A study on a microfluidic chip for high-throughput separation of various micro-particles in fluid: Case study with bio-particles

Abstract

유체 내 미세 입자 분리 기술은 수질 정화, 의공학 분야 등 다양한 분야에서 광범위하게 적용되고 있다. 예를 들면 수질 오염의 원인이 되는 미세 플라스틱, 임상에서 분석을 필요로 하는 혈액 내 세포 등이 있다. 유체 내에 존재하는 미세 입자를 분리하기 위해 미세유체역학을 기반으로 한 다양한 연구들이 진행되고 있다. 그러나, 현재까지 개발된 기술들은 처리 유량이 낮다는 한계점을 가지고 있어, 대량 샘플 처리 및 신속한 질병 진단과 같은 고 유량 조건이 필수인 연구에 적용하기 어려운 실정이다. 본 연구에서는 유체역학적 힘을 이용하여 유체 내 미세입자를 고 유량으로 분리하는 미세유체소자를 제안하고자 한다. 최종적으로, 제안한 소자를 패혈증 진단 과정에 적용하여 혈액 내 박테리아를 신속하게 분리하고자 하였다. 패혈증은 혈액 내 박테리아의 감염에 의해 생존율이 시간당 9%씩 급감하는 질병이다. 임상에서는 증상 발현 후 3시간 이내에 항생제 처방을 권고하고 있다. 적절한 항생제 처방을 위해서는 박테리아의 종을 확인하는 과정이 필요하지만, 이는 20시간 이상이 소요된다. 따라서, 항생제 내성을 유발함에도 불구하고 다종의 박테리아에 적용이 가능한 broad spectrum 항생제를 처방하고 있다. 이러한 문제점을 줄이기 위해서는 가장 오랜 시간이 소요되는 혈액 배양법의 대안이 필요하다. 혈액 배양법을 대체하기 위해서는 3시간 이내에 혈액 내 박테리아 분리 후, 종을 확인해야 한다. 그러나 혈액 내에는 박테리아에 비해 혈구 세포의 수가 너무 많기 때문에, 혈구 세포의 제거가 필요하다. 따라서 제안된 소자를 적용하여, 혈구 세포를 신속하게 분리 및 제거 후 박테리아를 회수하고자 하였다. 제안된 소자는 flat 채널 위에 반복된 미세 구조로 이루어진 채널을 추가하여 2차 유동을 형성하였다. 이로 인해 항력의 방향을 조정하여 고 유량에서의 입자 분리가 가능하도록 개선하였다. 입자의 질량이 클수록 입자가 가지는 관성이 큰 원리를 이용하여 혈구 세포와 박테리아를 분리하였다. 2차 유동에 의해 입자는 채널의 우측 벽면으로 이동한다. 적혈구(직경6~8 μm) 및 백혈구(직경14~20 μm)는 큰 관성을 가져 이동 방향이 변화하지 않으므로 우측 벽면에 정렬되며, outlet 1 에서 제거된다. 반면, 박테리아(직경 1 μm)는 비교적 작은 관성을 가져 이동 방향이 변화하므로 정렬되지 않고 채널 내에 균일하게 분포하여 outlet 1,2 로 배출된다. 최종적으로 박테리아는 outlet 2 에서 회수된다. 실험 결과 주입 유량 150 mL/h 조건에서 적혈구 및 백혈구는 97.8% 분리 및 제거되었으며, outlet 2 의 부피 수득률은 80.7% 이다. 실험 시 사용한 샘플의 적혈구 용적률은 2~4%이며, 패혈증의 병원성 박테리아인 Escherichia coli(E. coli) 와 Staphylococcus aureus(S. aureus) 가 103 CFU/mL 농도로 사용되었다. 회수된 박테리아는 현미경과 배양을 통해 형태 변형 및 생물학적 손상이 없는 것을 확인하였다. 결과적으로 임상에서 사용하는 전혈 10 mL 를 2시간 이내에 처리하여 박테리아의 75% 이상을 회수할 수 있을 것으로 예상된다. 이는 추후 적절한 항생제 선별까지의 시간을 단축시킴으로써 항생제 내성 유발을 감소시킬 수 있을 것으로 기대한다.|The separation technologies for micro-particles in the fluid has been widely applied in various fields such as water purification and biomedical engineering. Examples include micro-plastics that cause water pollution, and cells in the blood that require analysis in the clinic. Various studies based on microfluidics have been conducted to separate micro-particles in a fluid. However, the technologies developed to date have a limitation in that the treatment flow rate is low, and thus it is difficult to apply to studies in which high flow rate conditions are essential such as bulk sample processing and rapid diagnosis of disease. In this study, a microfluidic device is proposed that separates micro-particles in a fluid at high flow rates using hydrodynamic forces. Consequently, the proposed device is applied to the sepsis diagnosis process to quickly isolate bacteria in the blood. Sepsis is a disease in which the survival rate decreases by 9% per hour due to the infection of bacteria in the blood. In clinic, antibiotics treatment is recommended within 3 hours after symptom onset. Proper antibiotic treatment requires the identification of bacterial species, but the preprocess takes more than 20 hours. Therefore, a broad spectrum antibiotic that is applicable to a variety of bacteria is prescribed, despite inducing antibiotic resistance. This problem can be decreased by reducing the time required by replacing the blood culture method that takes the longest time. To replace the blood culture method, species of bacteria has to be identified after bacteria separation in the blood within 3 hours. However, since the number of blood cells in the blood is too large compared to bacteria, it is necessary to remove blood cells. Therefore, by applying the proposed device, it conducted to rapid separate and remove blood cells and recover bacteria. The proposed device forms a secondary flow by adding a channel composed of repeated microstructures on a flat channel. Due to this, the direction of drag was adjusted to improve particle separation at high flow rates. Blood cells and bacteria were separated using the principle that the magnitude of the drag received by the particle is proportional to the particle size. Red blood cells (Diameter: 6~8μm) and white blood cells (Diameter: 14~20μm) are aligned with the wall under great force and are removed from outlet 1. On the other hand, bacteria (Diameter: ~1μm) are not aligned due to a relatively small force and are uniformly distributed in the channel and discharged to outlets 1,2. Finally, the bacteria are recovered in outlet 2. As a result of the experiment, red blood cells and white blood cells were separated and removed by 97.8% at 150 mL/h, and the volume yield of outlet 2 was 80.7%. The hematocrit of the sample used in the experiment was 2~4%, and the pathogenic bacteria (Escherichia coli and Staphylococcus aureus) of sepsis were used at a concentration of 103 CFU/mL. The recovered bacteria were confirmed to be free of morphological deformation and biological damage through microscopic and culture. As a result, it is expected that more than 75% of bacteria can be recovered by treating 10 mL of whole blood for clinical use within 2 hours. This is expected to reduce the induction of antibiotic resistance by shortening the time to appropriate antibiotic screening in the future.