Evaluation of an Engineered Amyloid-β-Cleaving Enzyme NIa in a Mouse Model of Alzheimer’s Disease

Abstract

Alzheimer's disease (AD), the leading cause of dementia worldwide, is characterized by the progressive extracellular accumulation of amyloid-β (Aβ), a pathological hallmark strongly implicated in neuronal dysfunction and cognitive decline. Recent clinical successes with Aβ immunotherapy have reinforced the therapeutic value of enhancing Aβ clearance, motivating the development of novel enzymatic strategies that can directly and specifically degrade pathogenic Aβ species. Nuclear inclusion a (NIa), a plant viral protease derived from turnip mosaic virus, cleaves Aβ with strict sequence specificity, providing a uniquely selective enzymatic scaffold for this purpose. In Part I, I engineered a secretory form of NIa, designated SecNIa, by fusing an immunoglobulin leader sequence and a human IgG Fc (hFc) domain to enable extracellular Aβ targeting. SecNIa was efficiently secreted from transfected mammalian cells while fully retaining Aβ-cleaving activity. Adeno-associated virus-mediated delivery of SecNIa into 5xFAD mice produced robust hippocampal expression and confirmed secretion into the cerebrospinal fluid. SecNIa expression significantly reduced both soluble and insoluble Aβ levels and decreased hippocampal plaque burden. Cognitively, SecNIa fully normalized recognition memory and substantially improved spatial learning and memory in 5xFAD mice, without inducing a proinflammatory cytokine response. Notably, these cognitive benefits were not replicated by neprilysin, a well-characterized endogenous Aβ-degrading enzyme, despite comparable plaque reduction, suggesting that the mode of Aβ clearance is a critical determinant of cognitive outcome. In Part II, I further engineered SecNIa for systemic BBB-targeted brain delivery. FC5 nanobody-NIa fusion proteins were generated and confirmed to maintain activity in vitro, but FC5-hFc- (G4S)3-NIa could not achieve detectable brain delivery following intravenous administration due to rapid plasma clearance and insufficient BBB engagement. A systematic nanobody screen identified C10, a TfR1-targeting nanobody, as markedly superior in both secretion and plasma stability. Human serum albumin was selected as the optimal half-life extension partner over hFc fusion based on superior plasma stability in vivo. Subsequent linker and domain arrangement optimization established the rigid (EAAAK)₂ α-helical linker and N-terminal positioning of HSA as preferred design features. Critically, removal of an N-terminal FLAG-tag — found to sterically block C10-mediated receptor engagement at the BBB — yielded the final construct, C10-(EA3K)2-HSA-(EA3K)2-NIa, which demonstrated resistance to serum proteolysis over 24 hours. In vivo BBB penetration of this optimized construct remains to be validated and represents the immediate next step toward therapeutic application. Collectively, these studies establish SecNIa as an effective enzymatic strategy for Aβ clearance and cognitive rescue in AD model mice, and define a well-characterized, plasma-stable variant engineered for systemic brain delivery.|알츠하이머병은 전 세계적으로 치매의 가장 흔한 원인으로, 세포 외 아밀로이드- 베타(Aβ)의 진행성 축적을 주요 병리학적 특징으로 한다. 최근 Aβ 면역 치료의 임상적 성공은 Aβ 제거 향상이 유효한 치료 전략임을 강력히 지지하며, 병원성 Aβ 를 직접 표적화하는 새로운 효소적 접근법 개발의 필요성을 제시한다. 순무 모자이크 바이러스(TuMV) 유래 식물 바이러스 단백질 분해효소인 NIa 는 엄격한 기질 특이성으로 Aβ 를 절단하며, 이러한 목적에 부합하는 독보적인 효소적 기반을 제공한다. 본 연구의 첫 번째 파트에서는, NIa 에 면역글로불린 리더 서열과 인간 IgG Fc (hFc) 도메인을 융합하여 분비형 NIa(SecNIa)를 개발하였다. SecNIa 는 포유류 세포에서 효율적으로 분비되었으며 Aβ 절단 활성을 완전히 유지하였다. 아데노-부속 바이러스(AAV)를 이용하여 5xFAD 마우스의 뇌실 내에 SecNIa 를 전달한 결과, 해마에서의 강력한 발현과 뇌척수액으로의 분비가 확인되었다. SecNIa 의 발현은 가용성 및 불용성 Aβ 수준을 유의미하게 감소시키고 해마 내 플라크 부하를 저하시켰으며, 인식 기억을 완전히 정상화하고 공간 학습 및 기억을 현저히 개선하였다. 주목할 점은, 내인성 Aβ 분해효소인 네프릴리신(NEP)이 유사한 플라크 감소 효과에도 불구하고 인지적 이점을 나타내지 못하였다는 것으로, 이는 Aβ 제거의 방식이 인지 회복의 중요한 결정 인자임을 시사한다. 본 연구의 두 번째 파트에서는, SecNIa 를 전신 투여를 통한 혈뇌 장벽(BBB) 표적 단백질을 추가 개발하였다. FC5 나노바디-NIa 융합 단백질은 in vitro 상에서 활성을 유지하는 것이 확인되었으나, FC5-hFc-(G4S)3-NIa 는 급격한 혈장 청소율 및 불충분한 BBB 결합으로 인해 정맥 투여 후 뇌 조직에서 검출되지 않았다. 체계적인 나노바디 스크리닝을 통해 트랜스페린 수용체 1(TfR1)을 표적으로 하는 C10 나노바디가 분비 효율 및 혈장 노출 면에서 월등히 우수함을 확인하였다. In vivo 상에서 혈장 안정성 비교 평가를 통해 인간 혈청 알부민(HSA)이 hFc 융합보다 우수한 반감기 연장 파트너로 선정되었다. 이후 링커 및 도메인 배열 최적화를 통해 강직한 α-나선형 (EAAAK)₂ 링커와 HSA-N-말단 배열이 최적 설계임이 확인되었으며, N- 말단 FLAG 태그가 BBB 내피 세포에서의 C10-수용체 결합을 입체적으로 차단함을 발견하여 이를 제거한 최종 구조체 C10-(EA3K)2-HSA-(EA3K)2-NIa 를 도출하였다. 이 최종 구조체는 24 시간에 걸쳐 혈청 단백질 분해효소에 대한 내성을 나타내었다. 최적화된 구조체의 in vivo 상 BBB 투과 검증은 아직 수행되지 않았으며, 이는 치료적 적용을 위한 직접적인 다음 단계로 남아있다. 종합적으로, 본 연구는 SecNIa 가 알츠하이머병 마우스 모델에서 Aβ 를 효과적으로 제거하고 인지 기능을 회복시키는 효소적 치료 전략임을 확립하였으며, 전신 투여를 통한 뇌 표적 전달을 위한 혈장 안정성이 우수한 SecNIa 변이체의 특성을 규명하였다.