Allele-Specific Epigenetic Associations with Somatic Structural Variants in Hepatocellular Carcinoma Using Long-Read Sequencing

Abstract

Somatic structural variants （SVs） and aberrant DNA methylation are cardinal features of hepatocellular carcinoma （HCC）, yet whether these two axes of genomic instability are mechanistically coupled remains unresolved. Prior pan-cancer analyses relied on bulk bisulfite sequencing, which cannot distinguish allele- specific methylation imbalances from bilateral changes and systematically excludes repetitive genomic regions where SV-prone segmental duplications （SegDups） accumulate. Here, we leverage long-read sequencing to test whether SVs and haplotype-level methylation changes share a direct causal relationship or independently reflect a shared underlying genomic vulnerability. We performed PacBio HiFi whole-genome sequencing on paired tumor and adjacent non-tumor liver samples from 12 patients with HBV-associated HCC, enabling simultaneous capture of phased somatic structural variants （SVs） and 5-methylcytosine （5mC） profiles. Haplotype-resolved allele-specific differentially methylated regions （aDMRs） were identified using DSS on phased CpG counts. A six-layer analytical framework progressively assessed spatial enrichment, topological tier stratification, genomic fragility annotation, direct causality tests at haplotype resolution, RepeatMasker confound controls, and external validation in TCGA-LIHC cohort. Haplotype-resolved sequencing identified 573,093 allele-specifically unstable loci, of which 36.8% were exclusively detectable by the phased approach and invisible to bulk bisulfite simulation. Recurrently remodeled constitutional AMRs and somatic SV breakpoints were independently co-enriched at SegDup-rich loci with statistically indistinguishable effect sizes （multivariate OR = 2.25, p = 4.7 × 10⁻⁶ and OR = 2.11, p = 3.1 × 10⁻¹², respectively）. Refuting directional cis-induction, the SV-bearing haplotype was hypomethylated in only 51.5% of 8,616 cis-pairs （GLMER OR = 1.065, p = 0.146）. Furthermore, a locus- matched genome-wide linear mixed-effects model across 55,519 aDMRs confirmed no association between SV proximity and allelic methylation magnitude （β = −0.001, p = 0.562）. In contrast, HBV integration sites exhibited direct per-molecule allele-specific hypomethylation: HBV-junction-carrying DNA molecules were hypomethylated by a median of 11.6 percentage points within 1 kb of the insertion site （70.6% of loci, WSR p = 0.001）, with the HBV-bearing haplotype deviating from normal liver methylation in 70.1% of paired loci across all 7 affected patients. Haplotype resolution unveils two mechanistically distinct pathways of allele-specific methylation instability in HBV+ HCC. The dominant, genome-wide signal reflects a shared NAHR/SegDup genomic fragility substrate rather than directional cis-causation. Conversely, HBV integration constitutes a second, architecture-independent pathway providing direct per-molecule evidence of cis-allele-specific epigenetic disruption. These findings indicate that allele-specific long-read sequencing resolves questions inaccessible to conventional approaches, reframing the SV–methylation relationship from cause-and-consequence to co- occurring readouts of constitutive genomic fragility.|체세포 구조적 변이와 비정상적인 DNA 메틸화는 간세포암의 주요 특징이지만, 이 두 유전체 불안정성 축이 기전적으로 연결되어 있는지 여부는 아직 밝혀지지 않았다. 기존의 범암 분석은 bulk bisulfite sequencing에 의존했는데, 이는 대립유전자 특이적 메틸화 불균형을 양측성 변화와 구별할 수 없으며, 구조적 변이 （SV）가 발생하기 쉬운 분절 중복（SegDups）이 축적되는 반복적인 유전체 영역을 체계적으로 배제한다. 본 연구에서는 롱리드 시퀀싱을 활용하여 SV와 일배체형 수준의 메틸화 변화가 직접적인 인과 관계를 공유하는지, 아니면 기저에 있는 공통된 유전체 취약성을 독립적으로 반영하는지 검증하였다. 우리는 B형 간염 바이러스 관련 간세포암 환자 12명의 종양 및 인접 비종양 간 샘플 쌍에 대해 PacBio HiFi 전장 유전체 시퀀싱을 수행하여, 위상이 정렬된 체세포 SV와 5-메틸시토신 프로필을 동시에 포착하였다. 위상이 정렬된 CpG 카운트에 대해 DSS를 사용하여 일배체형으로 분해된 대립유전자 특이적 차별 메틸화 영역（aDMR）을 식별하였다. 6단계 분석 프레임워크를 통해 공간적 농축, 위상적 계층화, 유전체 취약성 주석, 일배체형 해상도에서의 직접적 인과성 테스트, RepeatMasker 교란 통제, 그리고 TCGA-LIHC 코호트에서의 외부 검증을 점진적으로 평가하였다. 일배체형 해상도 시퀀싱을 통해 573,093개의 대립유전자 특이적 불안정 유전자좌（loci）를 확인했으며, 이 중 36.8%는 위상 정렬 방식을 통해서만 검출 가능했고 벌크 바이설파이트 시뮬레이션에서는 관찰되지 않았다. 반복적으로 리모델링된 선천성 aDMR과 체세포 SV 중단점은 SegDup이 풍부한 유전자좌에서 독립적으로 동시 농축되었으며, 통계적으로 구별할 수 없는 효과 크기를 보였다（각각 다변량 OR = 2.25, p = 4.7 × 10⁻⁶ 및 OR = 2.11, p = 3.1 × 10⁻¹²）. 방향성 있는cis-유도 기작을 반박하듯, SV를 보유한 일배체형은 8,616개의 cis-쌍 중 51.5%에서만 저메틸화를 보였다（GLMER OR = 1.065, p = 0.146）. 또한, 55,519개의 aDMR에 걸친 유전자좌 일치 전장 유전체 선형 혼합 효과 모델에서 SV 근접성과 대립유전자 메틸화 크기 간에 연관성이 없음이 확인되었다（β = −0.001, p = 0.562）. 반면, HBV 통합 부위는 직접적인 분자 단위의 대립유전자 특이적 저메틸화를 보였다. HBV 결합부를 포함하는 DNA 분자는 삽입 부위 반경 1kb 이내에서 중앙값 기준 11.6%p 저메틸화되었으며（유전자좌의 70.6%, WSR p = 0.001）, HBV를 보유한 일배체형은 영향을 받은 7명의 환자 모두에 걸쳐 쌍을 이룬 유전자좌의 70.1%에서 정상 간의 메틸화와 편차를 보였다. 일배체형 해상도는 HBV 양성 간세포암에서 대립유전자 특이적 메틸화 불안정성의 기전적으로 구별되는 두 가지 경로를 밝혀낸다. 지배적인 전장 유전체 신호는 방향성 있는 cis- 인과성이라기보다는 공유된 비대립상동재조합/SegDup 유전체 취약성 기질을 반영한다. 반대로, HBV 통합은 cis-대립유전자 특이적 후성유전학적 교란에 대한 직접적인 분자 단위의 증거를 제공하는 두 번째 구조 독립적인 경로를 형성한다. 이러한 발견은 대립유전자 특이적 롱리드 시퀀싱이 기존의 접근법으로는 풀 수 없었던 문제들을 해결하며, SV와 메틸화의 관계를 '원인과 결과'에서 '선천적 유전체 취약성이 동시에 발현된 결과물로 재정립함을 시사한다.