Simultaneous Detection of Allergenic Proteins in Crustacean using High Resolution LC-MS

Abstract

많은 식품에 함유된 새우, 게, 가재 등의 갑각류에는 알레르기 반응을 일으킬 수 있는 항원성 물질이 존재합니다. 이를 예방하기 위한 알레르기 유발식품 표시제가 시행되고 있음에도 불구하고 식품의 섭취로 인한 알레르기 사례가 다수 보고되고 있습니다. 이에 대한 대표적인 원인 중 하나는 갑각류 종 간의 알레르기 유발 단백질의 구조적 유사성에 기인한 교차 반응입니다. 갑각류는 다른 동물에 비해 단백질 분석을 위한 종 특이적 단백질 서열 database가 부족합니다. 외골격이 존재하는 갑각류의 특성상 단백질의 추출이 어렵기 때문에 현재는 갑각류 각 종에 특이적인 알레르기 항원에 대한 연구만 진행된 상태입니다. 그래서 종 수준이 아닌 갑각류 수준에서 특이적으로 존재하는 교차 반응 유발 가능성이 있는 알레르기 항원에 대한 연구가 필요한 실정입니다. 본 연구에서는 식품 안전관리를 위하여 갑각류 수준에서 특이적으로 존재하는 알레르기 항원을 검출하였습니다. 이는 LC-MS 기반의 다성분동시분석법을 최적화하여 6종의 갑각류 원재료에 적용하여 갑각류 마커 펩타이드들을 발굴했습니다. 더 나아가 시판중인 가공식품에서도 해당 분석법을 이용하여 마커 펩타이드의 검출 가능성을 검증하였습니다. 이를 위해서 우선 갑각류로부터 살을 분리하여 여러 계면활성제 기반 추출법들을 비교분석하였습니다. 껍질의 경우, 미네랄 제거 과정을 추가로 포함하였습니다. 최적화된 추출법으로 추출한 후 단백질 동정에 주로 쓰이는 질량분석법인 DDA(Data Dependent Analysis)를 이용하였고, 각 종에서 평균 600개의 단백질을 동정하였습니다. 생물정보학 분석법인 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 이용하여 일반적으로 섭취하는 생물종 중 갑각류에만 존재하는 20개의 마커 펩타이드들을 선정하였습니다. 선정한 마커 펩타이드들의 식품 안전관리에서의 활용 가능성을 검증하기 위하여 열처리 등의 물리화학적 공정을 거친 시판 중인 가공식품들을 대상으로 다성분동시분석법을 최적화하였습니다. 그 결과 1시간 내에 20개의 마커 펩타이드들의 동시분석이 가능한 PRM(Parallel Reaction Monitoring) 기반 분석법을 확립하였고 반복분석을 통해 재현성까지 확인하였습니다. 본 연구의 갑각류에 최적화된 액체크로마토그래피-질량분석법 (LC-MS) 기반 다성분동시분석법은 기존 연구와 달리 처음으로 갑각류 수준의 특이적 알레르기 항원에 대한 마커를 발굴했습니다. 해당 마커들은 시판 중인 가공식품에서도 재현성 있는 검출이 검증되었습니다.|Many foods include crustaceans like shrimp, crab and lobster which can induce allergy reaction. To prevent allergy reaction, raw food that can induce allergy reaction must be labeled on the processed food if it is contained. However, in spite of this effort, accident of allergy reaction occurs by ingestion, and one of the main reason for this is cross reactivity. There is a lack of crustacean specific protein database comparing to other species. In addition, because of the exoskeleton existing on crustacean, protein extraction is challenging and only specific allergens for each species in crustacean has been reported. Therefore, allergens that can induce cross reactivity in crustacean level has to be studied. In this study, specific marker peptides for crustacean were detected by optimized simultaneous detection based on LC-MS. Six crustacean raw food was used for detection of marker peptides. Protein extraction was performed by three different buffers for flesh and shell was extracted separately. Each of the extracted proteins were compared by result of DDA and approximately 600 proteins were identified for each species. BLAST was used for selection of marker peptides that are specifically existing in crustacean that people generally eat. Finally, selected marker peptides were analyzed in 16 processed food by PRM. The result of this study suggests specific marker peptides in crustacean that might be allergens.