Investigating the role of tyrosine phosphorylation in ALK2 during BMP signaling

Abstract

While Bone Morphogenetic Protein(BMP) signaling has been known as a quintessential receptor serine/threonine kinase system, anecdotal evidence indicate that tyrosine phosphorylation of BMP type I receptors (BMPR1s) could be regulated under specific circumstances such as treatment with a specific ligand or in the presence of mutations in BMPR1s. These studies collectively imply the functional relevance of tyrosine phosphorylation in modulating the function of BMPR1s. However, precise molecular mechanisms of tyrosine phosphorylation in BMPR1s such as, the identity of tyrosine kinases which mediate tyrosine phosphorylation of BMPR1s and the target residues within BMPR1s, remain largely unknown. In this study, I examined the context of ligand-modulated tyrosine phosphorylation of BMPR1s, using ALK2 as an archetypical BMPR1. I investigated the relationships between ligand stimulation and tyrosine phosphorylation using phosphorylation of receptor-regulated SMAD(R-SMAD) as a readout. Overexpression of wild type ALK2 reveals tyrosine residues of ALK2 undergo basal level of phosphorylation which is attenuated in ligand-dependent manner. To assess the effect of tyrosine phosphorylation, a number of mutations replacing individual tyrosine residues with phenylalanine residues were synthesized and recombined to make phosphorylation-resistant form of ALK2. Overexpression of ALK2 mutants did not significantly reduce the level of tyrosine phosphorylation, suggesting that other residues may undergo phosphorylation in endothelial cells. Knock-down of tentative tyrosine kinase, ABL and SRC, for phosphorylation of ALK2 was performed to assess the effect of tyrosine phosphorylation using phosphorylation of R-SMADs as a readout however knockdown of ABL and SRC does not alter the phosphorylation of R-SMADs suggesting reduced tyrosine phosphorylation could be consequences of ligand-induced SMAD phosphorylation not a cause, if tyrosine residues undergo phosphorylation by ABL or SRC which should be examined further. Lastly, it was confirmed that tyrosine residue(s) of BMPR1s undergo phosphorylation which could suggest the tyrosine phosphorylation as a common regulatory mechanism of BMPR1s.|BMP 신호전달은 타이로신의 인산화로 조절되는 다른 수용체 시스템과는 다르게 수용체 인산화효소 중 유일하게 세린/트레오닌을 인산화시키는 것으로 알려진 신호전달체계입니다. BMP 신호전달체계에서는 세린/트레오닌의 인산화가 주로 연구되어왔지만 몇몇 연구들에서 특정 리간드처리나 비정상적인 신호전달 특성을 가지는 돌연변이에 의해 1형 BMP 수용체의 타이로신이 인산화된다는 보고가 있어왔습니다. 이러한 연구들은 타이로신의 인산화와 1형 BMP 수용체의 기능 조절의 연관성을 시사하는 것으로 생각됩니다. 하지만 현재까지 타이로신의 인산화는 BMP 신호전달체계에서 주목받지 못한 연구 주제로 1형 BMP 수용체의 타이로신 인산화가 어떤 인산화효소에 의해 어떻게 조절되는 지 그 메커니즘과 인산화효소에 의해 어느 위치의 타이로신 잔기가 인산화되는 지에 대해서는 현재까지 알려진 바가 많지 않습니다. 본 연구에서 저는 타이로신의 인산화가 1형 BMP 수용체에서 공통적으로 일어나는 현상임을 밝히고 1형 BMP 수용체의 타이로신 인산화가 리간드 처리에 의해 어떻게 변화하는 지를 1형 BMP 수용체 중 ALK2를 이용하여 확인하였습니다. 또한 R-SMADs를 통해 BMP 신호전달의 세기와 타이로신의 인산화사이에 어떠한 상관관계가 있는지를 확인하기 위해 타이로신 잔기를 페닐알라닌으로 바꿔 인산화가 불가능한 ALK2 돌연변이를 제작하였습니다. 혈관내피세포에서 ALK2 돌연변이를 과발현하였을 때 타이로신의 인산화 가 남아있는 것을 확인하였으며 이는 혈관내피세포에서 바뀐 타이로신 잔기 외에 추가적인 장소가 있음을 시사합니다. 타이로신의 인산화가 BMP 신호전달에 주는 영향을 확인하기 위해 BMP 신호전달과 연관되어 있을 것으로 생각되는 세포질 인산화효소인 c-ABL과 c-SRC를 siRNA를 이용하여 낙다운시켰을 때 BMP 신호전달의 신호 전달자로 역할하는 R-SMADs의 인산화정도가 변하지 않는 것을 통해 R-SMADs의 인산화가 c-ABL과 c-SRC의 발현에 크게 영향을 받지 않는 것을 확인하였습니다. 마지막으로, 타이로신 잔기의 인산화가 1형 BMP 수용체인 ALK1과 ALK2, ALK3에서 공통적으로 일어나는 현상임을 확인함으로서 ALK2 수용체에서 타이로신 인산화의 기능에 대한 연구가 다른 1형 수용체의 기능조절과도 연결될 수 있음을 확인하였습니다. 이를 통해 타이로신의 인산화가 1형 BMP 수용체의 기능을 조절할 수 있는 메커니즘으로 작용할 수 있는 가능성을 확인하였습니다.