Structural studies of the interaction between human Bloom’s syndrome protein, G-quadruplex DNA and Replication protein A

Abstract

DNA 풀림과 풀림을 조절하는 것은 DNA 복제나 전사와 같은 DNA 대사에 중요한 과정이다. DNA 풀림과 그 조절을 위해서 관여하는 다양한 생체분자 간의 상호작용 중 다음 세 상호작용을 연구하였다. 첫 번째는 Bloom’s syndrome protein RecQ C-terminal domain (BLM RQC) 과 G-quadruplex DNA (G4) 간의 상호작용이다. 먼저, NMR을 통해 상호작용에 참여하는 결합 표면이 RQC도메인의 β-wing이고 밀리초(millisecond) 수준의 dynamics를 가진다는 것을 알아냈다. 또한 수소-중수소 치환 실험을 통해 RQC도메인과 결합체를 형성하는 경우 G4 DNA의 imino proton이 중수소와 훨씬 빠른 속도로 치환된다는 것을 밝혔다. 추가적으로 CD를 이용해 RQC 도메인의 DNA를 풀 수 있는 기능이 서로 다른 G4 DNA구조에 대해서 어떻게 달라지는지 알아보았다. 마지막으로 ITC를 이용해 RQC-G4 상호작용의 열역학적 성질을 밝혔다. 이를 통해 RQC 도메인이β-wing 부분을 이용하여 G4와 상호작용하고 또, G4 DNA 구조를 풀 수 있다는 것을 알아내었다. 두 번째 상호작용은 BLM의 N 말단 부분과 RPA 70 kDa 서브유닛 간의 상호작용이다. 이 연구에서는 정확한 결합 부위와 결합 표면을 NMR을 통해 밝혔다. 먼저, BLM N말단 부분의 산성 아미노산을 다수 포함하고 있는 두 가지 서열이 RPA70N 도메인과 결합한다는 것을 알아내었다. 또한 이 결합에 이용되는 결합 표면은 RPA70N의 basic cleft 부분이라는 것을 규명했다. 마지막으로 RPA70N과 인산화된 RPA32의 N말단 간의 상호작용을 연구하였다. 이 연구에서는 인산화를 모방하기 위해 인산화되는 자리의 아미노산을 아스파트산으로 치환하였다. NMR을 이용해 RPA70N 도메인의 basic cleft 부분이 인산화모방RPA32(mp-RPA32)의 결합 표면으로 이용된다는 것을 알아내었다. 또한 fluorescence polarization competition assay를 통해 mp-RPA32가 RPA70N과 BLM 펩타이드 간의 결합을 방해할 수 있는 지 알아보았다. 그 결과, mp-RPA32에 의한 RPA70N - BLM펩타이드 간의 결합의 방해는 관측되지 않았고, 이는 결합의 방해를 위해서는 RPA70의 구조적 변이와 같은 추가적인 요소가 필요하다는 것을 말해주는 결과이다. 본 연구는 DNA 풀림과 풀림을 조절하는 과정에서 일어나는 여러 상호작용에 대한 구조적 정보를 제시하였다.|The DNA unfolding process is essential for DNA metabolisms such as replication and transcription. For the regulation of the DNA unfolding, several biological molecules interact with one another in a timely manner. Among them, I studied three interactions in detail. The first is the interaction between Bloom’s syndrome protein RecQ C-terminal domain (BLM RQC) and G-quadruplex (G4). BLM is one of five human RecQ helicases, and it resolves the DNA structure such as G4 for DNA metabolism. It is revealed that the β-wing region of the RQC domain is the binding surface for G4 interaction and experienced millisecond timescale dynamics using NMR spectroscopy. Our hydrogen-deuterium exchange data indicates that RQC can partially unfold the G4 structure. Also, the unfolding activity of the RQC domain toward various G4 topologies was investigated using CD spectroscopy. Finally, using ITC, the interaction between RQC and G4 is revealed as the entropically driven process. Second is the interaction between the RPA 70kDa subunit and the N-terminal of BLM. Two acidic-rich sequences located in the N-terminal region of BLM were specified as binding partners of the RPA70N based on CSP analysis. Our data showed that the basic cleft region of RPA70N is the binding site for both BLM peptides and that the acidic peptide/basic cleft interaction governs RPA-BLM binding. The third is intra-molecular interaction between the RPA70N and the phosphomimetic-RPA32 N-terminal region (mp-RPA32). Our NMR data revealed that the binding surface of RPA70N for mp-RPA32 is also the basic cleft region. Also, we performed competitive fluorescence polarization anisotropy assay (FPA) to test whether mp-RPA32 peptide inhibits the BLM peptide binding to RPA70N or not. However, in FPA, mp-RPA32 was not able to inhibit the binding between RPA70N and BLM peptides, and it suggests that other factors such as structural rearrangement in RPA70 are necessary for inhibition. Our study provides an expanded understanding of structural details of interaction that occur during DNA unfolding process.