Transcriptomic Responses of Testis to Aging and Ethanol in Mice

Abstract

PART I: Transcriptomic Responses of Testis to Aging in Mice Male reproductive aging, or andropause, is associated with gradual age-related changes in testicular properties, sperm production, and erectile function. The testis, which is the primary male reproductive organ, produces sperm and androgens. To understand the transcriptional changes underlying male reproductive aging, I performed transcriptome analysis of aging testes in mice. A total of 31,386 mRNAs and 9387 long non-coding RNAs (lncRNAs) were identified in the mouse testes of diverse age groups (3, 6, 12, and 18 months old) by total RNA sequencing. Of them, 1571 mRNAs and 715 lncRNAs exhibited changes in their levels during testicular aging. Most of these aging-related transcripts exhibited slight and continuous expression changes during aging, whereas some (9.6%) showed larger expression changes. The aging-related transcripts could be classified into diverse expression patterns, in which the transcripts changed mainly at 3-6 months or at 12-18 months. My subsequent in silico analysis provided insight into the potential features of testicular aging-related mRNAs and lncRNAs. I identified testis-specific aging-related transcripts (121 mRNAs and 25 lncRNAs) by comparison with a known testis-specific transcript profile, and then predicted the potential reproduction-related functions of the mRNAs. By selecting transcripts that are altered only between 3 and 18 months, I identified 46 mRNAs and 34 lncRNAs that are stringently related to the terminal stage of male reproductive aging. Some of these mRNAs were related to hormonal regulation. Finally, my in silico analysis of the 34 aging-related lncRNAs revealed that they co-localized with 19 testis-expressed protein-coding genes, 13 of which are considered to show testis-specific or -predominant expression. These nearby genes could be potential targets of cis-regulation by the aging-related lncRNAs. Collectively, my results identify a number of testicular aging-related mRNAs and lncRNAs in mice and provide a basis for the future investigation of these transcripts in the context of aging-associated testicular dysfunction.

PART II: Transcriptomic Responses of Testis to Ethanol in Mice Alcohol consumption is widely known to have detrimental effects on various organs and tissues. The effects of ethanol on male reproduction have been studied at the physiological and cellular levels, but no systematic study has examined the effects of ethanol on male reproduction-related gene expression. I employed a model of chronic ethanol administration using the Lieber-DeCarli diet. Ethanol-fed mice showed normal testicular and epididymal integrity, and sperm morphology, but decreased sperm count. Total RNA sequencing analysis of testes from ethanol-fed mice showed that a small fraction (∼ 2%) of testicular genes were differentially expressed in ethanol-fed mice and that, of these genes, 28% were cell-type specific in the testis. Various in silico analyses were performed, and gene set enrichment analysis revealed that sperm tail structure-related genes, including forkhead box J1 (Foxj1), were down-regulated in testes of ethanol-fed mice. Consistent with this result, ethanol- fed mice exhibited decreased sperm motility. This study provides the first comprehensive transcriptomic profiling of ethanol-induced changes in the mouse testis, and suggests gene expression profile changes as a potential mechanism underlying ethanol-mediated reproductive dysfunction, such as impaired sperm motility.|Part I. 생쥐에서의 노화에 따른 정소 전사체 반응 남성 생식 노화 (Andropause)는 정소의 구조 및 기능 변화, 정자 생성 감소, 발기 기능 저하 등과 관련된 점진적인 생리적 변화로 정의된다. 본 연구에서는 생쥐 고환의 연령별 전사체 분석을 통해 생식 노화에 수반되는 전사적 변화를 규명하고자 하였다. RNA 시퀀싱을 통해 3, 6, 12, 18 개월령 생쥐 정소에서 31,386 개의 mRNA 와 9387 개의 긴 비암호화 RNA (lncRNA)를 동정하였으며, 이 중 1571 개의 mRNA 와 715 개의 lncRNA 가 연령에 따라 유의한 발현 변화를 보였다. 대부분의 노화 관련 전사체는 작고 점진적인 발현 변화 양상을 보였으나, 약 9.6%는 뚜렷한 변화 폭을 나타냈다. 발현 패턴 분석을 통해 이들 전사체는 3–6 개월 또는 12–18 개월 구간에서 주요한 변화를 보이는 군으로 분류되었다. 이어진 in silico 분석을 통해 정소 특이적 전사체와의 비교를 통해 노화 관련 정소 특이 전사체(121 개 mRNA, 25 개 lncRNA)를 규명하였고, 일부는 생식 기능 조절과 관련된 기능을 가질 것으로 예측되었다. 특히, 3 개월과 18 개월 사이에서만 변화하는 전사체를 기준으로 노화와 연관된 mRNA(46 개)와 lncRNA(34 개)를 선별하였으며, 일부는 호르몬 조절에 관여하는 것으로 나타났다. 또한, 노화 관련 lncRNA 중 34 개는 정소 특이적으로 발현되는 단백질 코딩 유전자(19 개)에 가까이 위치 (co-localize)하며, 이들 중 13 개는 cis-조절의 잠재적 표적일 수 있음을 제시하였다. 본 연구는 정소 노화와 관련된 전사체 네트워크를 포괄적으로 제시하며, 남성 생식 기능 저하의 분자적 기전을 이해하는 데 기초 자료를 제공한다.

Part II. 생쥐에서의 에탄올 급여에 따른 정소 전사체 반응 알코올 섭취는 다양한 장기와 조직에 해로운 영향을 미치는 것으로 널리 알려져 있다. 에탄올이 남성 생식에 미치는 영향은 생리학적 및 세포 수준에서 여러 차례 연구되었지만, 생식 관련 유전자 발현에 미치는 영향을 체계적으로 분석한 연구는 없었다. 본 연구에서는 Lieber-DeCarli 식이법을 이용한 만성 에탄올 급여 모델을 사용하였다. 에탄올을 투여받은 마우스는 정소과 부정소의 구조적 이상은 없었으며, 정자 형태 역시 정상이었으나 정자 수는 감소하였다. 에탄올 급여 마우스의 정소에 대해 수행한 RNA 시퀀싱 분석 결과, 정소 유전자 중 약 2% 정도만이 차등 발현되었으며, 이 중 28%는 정소 내의 세포 특이 발현 유전자였다. 다양한 in silico 분석을 수행한 결과, 유전자 집합 풍부도 분석 (GSEA)에서 Foxj1 을 포함한 일부 정자 꼬리 구조 관련 유전자의 발현이 감소됨이 확인되었다. 이러한 결과에 부합하게, 에탄올 급여 마우스는 정자 운동성 감소를 보였다. 본 연구는 에탄올 급여에 따른 정소 전사체 변화를 포괄적으로 규명한 최초의 연구로서, 에탄올로 인한 생식 장애, 특히 정자 운동성 저하의 잠재적 기전으로서 유전자 발현 변화의 가능성을 제시한다.