Regulation of alternative splicing patterns of the Bcl-x gene by YTHDC1

Abstract

YTHDC1은 mRNA 상의 N6-메틸아데노신(N6-methyladenosine, m⁶A)을 특이적으로 인식하는 핵 내 m⁶A 리더 단백질이다. 대체 스플라이싱(Alternative splicing, AS)은 고등 진핵세포에서 일어나는 전사 후 과정으로, 하나의 유전자로부터 다양한 mRNA을 생성하고 이로 하여 다양한 단백질 isoforms을 생산할 수 있게하는 mechanism이다. 기존 연구에서는 YTHDC1이 SRSF3 모집과 SRSF10 차단을 통해 대체 스플라이싱을 조절한다는 사실이 일부 밝혀졌지만, YTHDC1이 스플라이싱을 조절하는 정확한 기작에 대한 연구는 아직 부족하다. 본 연구에서는 YTHDC1을 knockdown (KD)한 세포로부터 추출한 RNA를 기반으로, RNA 스플라이싱에 대한 바이오인포매틱 분석을 수행하였다. 그 결과, 총 259개의 5' splice site (5′ SS) 선택 변화 이벤트를 확인하였으며, 이는 YTHDC1이 5′ SS 선택에 필수적인 역할을 한다는 것을 시사한다. Gene Ontology 분석 결과, YTHDC1은 전반적인 5′ SS 선택을 조절하는 기능을 가지는 것으로 나타났다. YTHDC1의 타깃 중 하나인 Bcl-x 유전자는 exon 2b을 대상으로 대체 5′ SS 선택을 통해 항세포사멸성(Bcl-xL) 및 친세포사멸성(Bcl-xS) isoforms을 생성하므로, YTHDC1의 조절 메커니즘을 연구하기 위한 모델로 선택되었다. 이후 추가적인 YTHDC1 PAR-CLIP 데이터로 YTHDC1이 Bcl-x pre-mRNA와 직접적으로 결합한다는 가능성을 확인하였다. 데이터를 검증하기 위하여 추가적인 실험을 진행하였다. 우선적으로 YTHDC1 KD 세포에서 Bcl-x의 RT-PCR 분석을 통해 RNA-seq 결과를 재확인하였으며, YTHDC1 KD가 Bcl-xS isoform의 생성을 촉진함을 실험적으로 입증하였다. YTHDC1이 KD 되었을 때 exon 2b가 포함되어있지 않은 Bcl-xS isofrm이 늘어났기에 YTHDC1이 exon 2b의 inclusion을 촉진되는 지를 확인하기 위해 co-overexpression 실험을 진행하였다. 2a, 2b, intron 2 일부, exon 3을 포함한 Bcl-x minigene을 활용하여 YTHDC1이 과발현되었을 때 Bcl-xS isoform 생성을 억제하고 Bcl-xL가 증가함을 확인하였다. 다만 이러한 변화량은 KD 실험때와 비교하였을 때 적은 영향력을 보여주어 Bcl-x minigene을 디자인하며 deletion된 부분이 YTHDC1 또는 다른 co-factor들과 상호작용 할 수도 있다는 가능성을 보여준다. 마지막으로, YTHDC1 일부 결실된 mutant (YTH, ΔYTH)들과 m⁶A recognition 관련 트립토판을 변화시킨 mutant(W377A, W428A, W377, W428A)를 제작하여 Bcl-x minigene과 co-overexpression을 진행하여 YTHDC1의 어떠한 영역이 Bcl-x 대체 스플라이싱에 필요로 하는지를 확인했다. 그 결과 대조군으로 사용한 Wild type을 제외한 모든 mutant의 경우에서 exon 2b inclusion의 변화에 큰 영향이 없음을 관찰하였다. 이 결과는 5’ SS 선택을 조절하기 위해서 온전한 YTHDC1이 필요로 함을 시사한다. 따라서 YTHDC1은 온전한 형태로서 Bcl-x pre-mRNA의 5‘ SS 선택의 조절인자로 작용하여 Bcl-x의 exon 2b inclusion을 촉진한다는 결론을 내렸다.|YTHDC1 is a nuclear N6-methyadenosine (m⁶A) reader protein that specifically recognizes N6-methyadenosine on mRNA. Alternative splicing (AS) is an posttranscriptional process occurs in higher eukaryotic cells by which mutipled mRNA isoforms are produced from a gene. Although YTHDC1 has been shown to regulate alternative splicing through recruiting SRSF3 and blocking SRSF10 in some instances, the mechanistic insight of YTHDC1 in alternative splicing is still lacking. Using bioinformatics analysis of RNA splicing with RNAs from YTHDC1-knockdown (KD) cells. I identified 259 of altered 5’ splice site (SS) selection events indicating that YTHDC1 plays essential roles in alternative 5’ SS selection. Gene Ontology analysis showed that YTHDC1 globally regulates 5’ SS selection. Among the target 5’ SS targets of YTHDC1, I selected Bcl-x, which produces an proapototic Bcl-xS and antiapototic Bcl-xL, by alternative 5’ SS selection, to study the regulatory roles of YTHDC1 in 5’SS selection. First, I confirmed the RNA-seq results by performing RT-PCR analysis of Bcl-x in YTHDC1 KD cells to demonstrate that YTHDC1 KD promotes Bcl-xS production. Second, I applied a Bcl-x minigene including exon 2a, 2b, part of intron 2, and exon 3 to show that YTHDC1 overexpression inhibited Bcl-xS isoform. Last, I produced YTH domain deletion, m⁶A recognition amino acid mutatns to show that either YTH domain or specific amino acids (Tryptophan at postitions 377 and 428) are required for the splicing regulatory functions of YTHDC1. My results suggest that YTHDC1 is an essential regulatory protein in 5’ splice site selection.