Development of a sequence-based RNA purification method with a single-nucleotide resolution by synthesis and selection

Abstract

The accuracy of synthetic RNA is critical for the success of RNA therapeutics. However, current RNA purification methods rely on physicochemical properties such as length or charge, which make it hard to effectively distinguish sequences with single-nucleotide errors. To overcome this limitation, we developed a novel sequence-based RNA purification platform capable of purifying error-free RNAs at single-nucleotide resolution. Our method operates through a synthesis and selection mechanism utilizing modified deoxynucleotide triphosphates (dNTPs). It involves stepwise elongation with sequence-specific dNTPs, combined with blocking steps using a triple combination of dideoxynucleotide triphosphates (ddNTPs) to prevent the extension of erroneous templates. Final labeling with biotin-modified dNTP enables the selective capture of error-free RNA molecules. We validated this strategy using prime editing guide RNAs (pegRNAs), which are over 160 nucleotides in length and have a complex secondary structure. Next-generation sequencing (NGS) analysis of the purified pegRNAs demonstrated a global reduction in errors across most regions of target sequence, with notable decreases in deletion and substitution errors. Compared to unpurified controls, the purified pegRNAs showed an average increase of 2.59 percentage points in overall purity, underscoring the effectiveness of our method. This approach offers an indispensable solution for the precise purification of synthetic RNAs and holds strong potential for enhancing the quality and performance of RNA therapeutics.|합성 RNA의 서열 정확성은 RNA 치료제의 성공적인 적용에 있어 매우 중요한 요소이다. 그러나 현재 널리 사용되는 정제 기술은 길이나 전하 등 물리화학적 특성에 의존하고 있어, 단일 염기 오류와 같은 정밀한 구별에는 한계가 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 본 연구에서는 단일 염기 분리능을 갖는 새로운 서열 기반 RNA 정제 플랫폼을 개발하였다. 본 기술은 변형된 디옥시뉴클레오타이드(dNTP)를 이용한 합성과 선택 기작을 기반으로 하며, 정확한 서열에 대해 단계적으로 dNTP를 합성하고, 비정상 서열의 경우 목표 서열에 상보적이지 않은 조합의 ddNTP로 신장을 종결했다. 마지막으로 Biotin이 표지된 dNTP를 통해 오류 없는 RNA만을 선택적으로 회수한다. 모든 반응은 자성 비드 위에서 수행되어 용액 교환과 세척이 용이하였다. 이러한 전략은 162 nt 길이와 복잡한 2차 구조를 가진 prime editing guide RNA(pegRNA)에 적용되어 유효성을 검증하였다. 차세대 염기서열 분석(NGS)을 통해 정제된 pegRNA는 전체 서열 영역에서 오류가 감소했으며, 특히 결실(deletion) 및 치환(substitution) 오류가 크게 줄어드는 양상을 보였다. 정제 전후를 비교한 결과, 정제된 RNA의 평균 순도는 2.59 %p 향상되어 합성 RNA에 대한 본 방법의 유의미한 개선을 확인하였다. 본 정제 플랫폼은 기존 RNA 정제 방식의 한계를 극복하고, 정밀한 합성 RNA 정제를 가능하게 하는 기술이다. 또한 본 플랫폼은 높은 유연성을 바탕으로 siRNA, CRISPR guide RNA 등 다양한 합성 RNA의 정제에 활용할 수 있으며, 치료제의 품질과 성능을 향상시킬 수 있는 높은 확장성과 실용성을 지닌다. 본 연구는 서열 특이적 정제를 통한 고정밀 RNA 품질 관리의 새로운 가능성을 제시하며, RNA 생명공학 분야에 중요한 발전을 이끌 수 있는 기술적 기반을 마련하였다.