Biophysical Investigations of DNA-Binding Proteins from Archaea to Humans

Abstract

Aging and genome instability are fundamental biological challenges associated with the progressive accumulation of cellular stress and DNA damage. Proteins involved in DNA replication, repair, and gene regulation play essential roles in maintaining genomic integrity, particularly under extreme environmental conditions or during cellular senescence. Understanding the structural and functional properties of these proteins not only offers insight into fundamental molecular mechanisms but also provides avenues for therapeutic development. This dissertation explores the biophysical and structural characteristics of DNA-binding proteins across three systems: archaea, human DNA replication machinery, and transcription factors (TF). A multidisciplinary approach was employed, combining nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, molecular dynamics simulation, and other biophysical techniques. In Chapter 1, I examined the thermostability and DNA-binding mechanism of the single-stranded DNA-binding protein (SSB) from the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus (Sso). Using solution- state NMR spectroscopy, circular dichroism (CD), differential scanning calorimetry (DSC), and hydrogen- deuterium exchange (HDX), I characterized the secondary structure, DNA-binding interface, and structural flexibility of SsoSSB under high-temperature conditions. Although rational mutagenesis guided by HDX data and MutCompute predictions was performed, none of the tested variants exhibited improved thermostability. These findings provide insight into how thermophilic proteins maintain structural integrity and function at elevated temperatures, informing strategies for the rational design of thermostable proteins. Chapter 2 focuses on the molecular interaction between minichromosome maintenance protein 6 (MCM6) and Bloom syndrome helicase (BLM), both critical regulators of DNA replication and genome integrity. Through NMR-based chemical shift perturbation (CSP), paramagnetic relaxation enhancement (PRE), and fluorescence polarization assays (FPA), I mapped the interaction between the winged-helix domain of MCM6 and the minimal binding region of BLM. Structural modeling and electrostatic analysis identified complementary interfaces, while evolutionary conservation supported functional relevance. These results reveal a bipartite interaction that may coordinate origin licensing and fork resolution under replication stress. In Chapter 3, I examined how FOXO4, a forkhead TF, recognizes and differentiates between target and non-target DNA sequences. Emphasis was placed on the role of flexible structural elements, including the W2 region and the S2–W1 loop. Using TITAN line shape analysis, NMR spectroscopy, and Molecular dynamics simulations, I demonstrated that these regions contribute to binding plasticity, electrostatically driven scanning, and autoinhibitory conformations. Site-directed mutagenesis confirmed their role in modulating specificity and affinity. Comparative simulations across FOXO family members suggest a conserved strategy for regulating DNA interaction via dynamic conformational states. This dissertation presents a detailed structural and dynamic analysis of DNA-binding proteins operating across diverse biological contexts, including archaea, DNA replication machinery, and TFs. By integrating high-resolution experimental data with computational modeling, I provide mechanistic insights into protein thermostability, domain-specific interactions, and sequence recognition. These findings contribute to a deeper understanding of how structural flexibility and conserved motifs regulate protein function and may inform future efforts in protein engineering and molecular therapeutics.|세포 스트레스와 DNA 손상의 축적으로 인한 유전체 불안정성은 생물학적으로 중요한 과제이며, DNA 복제, 수선, 전사 조절에 관여하는 단백질들은 유전체 안정성을 유지하는 데 핵심적인 역할을 수행한다. 본 박사학위 논문은 세 가지 시스템 (고세균, DNA 복제 조절 기작, 전사 조절 인자)에 존재하는 핵산 결합 단백질들의 구조적 및 생물물리학적 특성을 규명하고자 하였으며, 핵자기 공명 분광법, 분자동역학 시뮬레이션 등, 다양한 생화학적 분석 기법을 통합적으로 활용하였다. 제1장에서는 온천에서 생존하는 고세균 Sulfolobus solfataricus의 단일 가닥 DNA 결합 단백질의 열안정성과 DNA 결합 메커니즘을 조사하였다. 용액상 핵자기 공명 분광법, 원편광 이색성 분광광도계, 시차 주사 열량계, 수소-중수소 교환 분석을 통해 SsoSSB의 이차 구조, 결합 표면, 유연성 등을 고온 환경에서 분석하였으며, 수소-중수소 교환 분석과 MutCompute 기반 예측을 바탕으로 설계된 돌연변이체들이 향상된 열안정성을 보이는 것을 확인하였다. 제1장은 고온 안정 단백질의 기능적 구조 유지 전략을 이해하는 데 기여한다. 제2장에서는 DNA 복제와 손상 수선에 핵심적인 역할을 하는 MCM6 단백질과 Bloom 증후군 헬리케이스 간의 상호작용을 구조적 수준에서 규명하였다. 핵자기 공명 분광법 화학적 이동 변화, 상자성 완화 증강, 형광 편광 분석을 활용하여 MCM6의 winged-helix domain과 Bloom 증후군 헬리케이스의 최소 결합 도메인 사이의 결합 인터페이스를 밝혔다. 구조 모델링, 전하 분석, 보존성 분석을 통해 이들 도메인의 기능적 상호작용이 복제 기작 및 복제 스트레스 상황에서 조절된다는 점을 제시하였다. 제3장에서는 전사인자인 FOXO4의 forkhead domain이 DNA 서열을 인식하는 특이성 메커니즘을 탐구하였다. 특히 유연한 구조 요소인 W2 영역과 S2–W1 루프의 역할에 집중하였으며, TITAN 선형 분석, 핵자기 공명 분광법, 분자동역학 시뮬레이션을 통해 이들 영역이 DNA 결합의 전하 기반 스캐닝 및 자동 억제 기전에 기여함을 확인하였다. 표적 서열 및 비표적 서열에 대한 결합 비교 분석과 FOXO 계열 단백질 간 시뮬레이션 비교를 통해 이들 조절 기작의 보존성을 제안하였다. 본 논문은 고세균에서 사람의 전사인자까지 다양한 생물학적 시스템에서의 핵산 결합 단백질들을 대상으로 구조적 유연성과 결합 특이성에 관한 종합적 생물물리학적 분석을 수행하였다. 고해상도의 실험 자료와 시뮬레이션 기반의 계산 접근법을 융합하여 단백질의 열안정성, 도메인 간 상호작용, 서열 인식 메커니즘에 대한 통합적인 기전을 제시하였으며, 이는 향후 단백질 공학 및 치료제 개발에 유용한 기반 지식을 제공한다.