Studies on the Novel Targeted Anti-Cancer Agents for Acute Myeloid Leukemia

Abstract

Acute myeloid leukemia (AML) is a hematopoietic stem cell malignancy characterized by dysfunction of the hematopoietic system, abnormal proliferation, and obstruction of differentiation. Mutations in Fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3) have been implicated in the pathogenesis of AML, and several FLT3 inhibitors have been developed for the treatment of AML. However, the occurrence of secondary TKD mutations in FLT3, such as FLT3/D835Y and FLT3/F691L, has led to drug resistance and has become a key area of unmet medical needs. To solve the problem of secondary TKD mutations, a new series of indirubin-3′-aminooxy-acetamide derivatives were discovered as potent and selective FLT3, FLT3/D835Y, and FLT3/F691L inhibitors that were predicted to bind at the DFG-in active conformation of FLT3 in molecular docking studies. Through structure-activity relationship studies, the most optimized compound 13a was developed as a potent inhibitor of FLT3 and FLT3/D835Y with IC50 values of 0.26 nM and 0.18 nM, respectively, which also displayed significantly strong in-vitro anticancer proliferation activities, with single-digit nanomolar GI50 values for various AML (MV4-11 and MOLM14) and Ba/F3 cell lines expressing secondary TKD mutated FLT3 kinases as well as FLT3-ITD. The selectivity profiles of compound 13a were estimated in various human cancer cell lines and a panel of oncology kinases, demonstrating that 13a mainly inhibits both activities of a few members of the receptor tyrosine kinase family and proliferation of AML cell lines. Furthermore, compound 13a significantly suppressed tumor growth in xenografts implanted with FLT3-ITD/D835Y-expressing MOLM-14 cells. Since drug resistance occurs rapidly by mutations, the continuous discovery and drug development focusing on new therapeutic targets are very important for the treatment of AML. N6A-methyladenosine (m6A) post-transcriptional modification, the most abundant internal RNA modification, is catalyzed by the METTL3-14 methyltransferase complex. Recently, the METTL3-14 complex has attracted attention for its important role in the pathogenesis of acute myeloid leukemia (AML), raising the potential of novel therapeutic targets for the disease. In this study, two kinds of allosteric inhibitors of the METTL3-14 complex were identified through screening of the drug library from the Korea Chemical Bank. First, I developed and discovered the first allosteric inhibitor of the METTL3-14 complex based on structure-activity relationship (SAR) and optimization studies of the hit compound, 4-[2-[5-chloro-1-(diphenylmethyl)-2-methyl-1H-indol-3-yl]-ethoxy]benzoic acid (CDIBA). CDIBA-based METTL3-14 allosteric inhibitor 43n was optimized across modifications in 4 different regions of the structure, and it exhibited potent enzyme inhibitory activity of the METTL3-14 complex and anti-proliferative effects in several AML cell lines by suppressing the m6A level of mRNA. The inhibition mechanism and binding mode of 43n were revealed with a reversible and noncompetitive inhibitory profile at the allosteric site along with selectivity for the METTL3-14 complex relative to each subunit enzyme or truncated complex enzyme. Second, I identified and characterized eltrombopag as a selective allosteric inhibitor of the METTL3-14 complex. Eltrombopag displayed selective inhibitory activity in the active catalytic form of the METTL3-14 complex by direct binding, and the compound may noncompetitively interacts at a putative allosteric binding site of METTL3, which was predicted by cavity search and molecular docking studies. Eltrombopag exhibited anti-proliferative effects in several AML cell lines, including MOLM-13, in correlation with a reduction in m6A levels. Molecular mechanism studies of eltrombopag using m6A-seq analysis provided additional evidence for the hypomethylation of leukemogenic genes in eltrombopag-treated MOLM-13 cells and the overlapping of the pattern with those of METTL3-knockdown MOLM-13 cells. In conclusion, compound 43n and eltrombopag were first disclosed as functional METTL3-14 allosteric inhibitors in AML cells, which could be utilized for the further development of novel anti-AML therapy.|Fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3)의 돌연변이는 혈액암인 급성 골수성 백혈병에 주요 발병 원인으로서, 급성 골수성 백혈병 치료를 위한 표적으로 주목받으며 많은 저해제들이 개발되었다. 하지만 2차 TKD 돌연변이로 인한 기존 FLT3 저해제에 대한 저항성이 발생하여, 이를 극복하기 위한 추가적인 약물의 개발이 필수적인 상황이다. 이러한 문제를 해결하기 위해, FLT3의 DFG-in 활성 형태에서 결합할 것으로 예측되며 강력하고도 선택적으로 FLT3, FLT3/D835Y 및 FLT3/F691L를 저해하는 새로운 시리즈의 인디루빈-3'-아미노옥시-아세트아미드 유도체들이 발견되었다. 구조-활성 상관관계 연구를 통해 최적화된 화합물 13a는 FLT3 (IC50 = 0.26 nM)와 FLT3/D835Y (IC50 = 0.18 nM)에 대해 강력하고 선택적인 저해 활성을 보였으며, 급성 골수성 백혈병 세포주에서도 한 자릿수의 nanomolar GI50 값을 나타내며 강력한 세포 수준의 항암 효능을 보였다. 또한, 다양한 인간 암 세포주 및 발암성 키나아제 패널에서 평가된 화합물 13a의 저해활성 경향은 화합물 13a가 선택적으로 소수의 티로신 키나아제 패밀리의 활성과 급성 골수성 백혈병 세포주의 증식을 억제한다는 것을 입증했다. 더 나아가, 화합물 13a는 FLT3-ITD/D835Y가 발현된 MOLM-14 세포 이종이식 쥐 모델에서 유의미하게 종양 성장을 억제하며 생체 내 적용 가능성도 확인되었다. 가장 풍부한 내부 RNA 변형인 N6A-메틸아데노신(m6A)을 촉매하는 METTL3-14 복합체는 급성 골수성 백혈병의 발병기전에서 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀짐에 따라 새로운 치료 표적으로서 주목받고 있다. 본 연구에서는 새로운 급성 골수성 백혈병 치료제를 개발하기 위해 한국화홥물은행 약물 라이브러리를 스크리닝하였고, 그 결과 2종의 METTL3-14 복합체의 알로스테릭 억제제를 발견하였다. 1) 첫 번째 유효물질인 CDIBA의 구조-활성 상관관계 연구 및 최적화 연구를 통해 METTL3-14 복합체의 첫 번째 알로스테릭 억제제를 개발하고 발견하였다. 그중에서, 인돌 기반 화합물 43n은 CDIBA 구조의 4가지 다른 영역에 변형을 주어 최적화되었으며 METTL3-14 복합체에 대한 강력한 효소 억제 활성과 세포 단계에서 m6A의 수준을 감소시키며 여러 급성 골수성 백혈병 세포주에서 항증식 효과를 나타냈다. 또한 화합물 43n는 알로스테릭 부위에서 가역적 및 비경쟁적 억제 기전을 나타냈으며 METTL3-14 단일 형태보다는 복합체에서 선택적으로 작용한다는 것이 밝혀졌다. 2) 두 번째 유효물질인 엘트롬보팩은 직접적인 결합으로 인해 METTL3-14 복합체에서 선택적 억제 활성을 나타내며, 분자 도킹 연구와 기전 연구를 통해 METTL3의 알로스테릭 결합 부위에서 비경쟁적으로 상호작용하는 것이 확인되었다. 또한 엘트롬보팩은 세포 단계에서 m6A 수준을 감소시키며 MOLM-13을 포함한 여러 급성 골수성 백혈병 세포주에서 항증식 효과를 나타냈다. 더 나아가, m6A-seq 분석을 통한 엘트롬보팩의 분자 기전 연구는 엘트롬보팩 처리된 MOLM-13 세포에서 백혈병 유전자의 저메틸화 발생을 확인함에 따라 엘트롬보팩의 항백혈병적 분자 기전을 설명하였다. 결론적으로, 화합물 43n과 앨드롬보팩은 METTL3-14 알로스테릭 억제제로 처음 공개되었으며, 이는 새로운 급성 골수성 백혈병 치료 요법으로서의 추가 개발에 사용될 수 있다.