Sensory-evoked Optical Intrinsic Signal Imaging of an Animal Model of Neuropathic Pain

Abstract

말초신경병증성 통증(Peripheral neuropathic pain)의 정의는 “말초 체성 감각 신경계의 병변 또는 질병으로 인한 통증(Pain caused by a lesion or disease of the peripheral somatosensory nervous system)”으로써, 노인성 질환인 대상포진, 당뇨병 또는 화학요법 등으로 인한 말초신경의 손상이 주요한 원인으로 알려져왔다. 말초신경의 손상은 대뇌의 1차 체성감각피질(primary somatosensory cortex)에 생리학적인 변화를 일으키며, 이로 인해 환자는 통각과민(hyperalgesia) 및 무해자극통증(allodynia) 등의 만성적인 통증에 시달리게 된다. 신경병증성 통증은 만성 통증으로 환자의 삶의 질을 떨어뜨리고 시간이 지날수록 악화될 수 있기 때문에 조기에 진단하고 치료하는 것이 중요하다. 대부분의 만성 통증 환자는 신경병통증과 통각통증이 혼재되어 있는 경우가 많으며, 만성 통증 환자에서 신경병통증 동반 여부를 파악하고 이를 진단하기 위해서 환자가 작성하는 설문지나 검사자의 인터뷰를 통하여 통증의 부위, 통증의 종류와 크기 등, 통증의 양상을 파악한다. 하지만 이러한 설문 및 인터뷰 기반의 진단 방식은 환자의 주관적 의견에 의존하여 진단결과가 도출된다는 한계가 있다.

신경병증성 통증의 조기진단 및 통증의 증상과 예후의 정량적·정성적 평가를 위한 다양한 방식의 바이오마커 후보군에 대한 연구가 지속적으로 이루어져 왔다. 특히 임상 및 전임상 시험에서 모두 활용할 수 있는, 즉, 실험동물과 사람에서 동일한 매커니즘 및 양상을 보이는 중개연구 바이오마커(translation biomarker)의 발굴에 대한 개발에 대한 관심이 높다. 이러한 중개연구 바이오마커의 개발은 신경병증성 통증의 발병 및 치료기전 규명과 치료법 개발을 위해 중요한 역할을 할 것으로 기대된다. 신경병증성 통증의 다양한 바이오 마커중에서 정량적 감각 시험 (quantitative sensory testing, QST)은 감각 바이오마커의 유망한 후보로써 환자의 약리학적 치료에 대한 예후 마커로 지목되고 있다. 하지만, 아직은 이에대한 결정적인 증거가 부족하여 추가적인 연구가 필요하다.

말초신경의 손상으로 인한 만성 통증 발생의 기전 연구를 위해 다양한 전임상 동물 모델이 제시되었으며, 말초신경의 손상이 대뇌 피질에 미치는 영향을 관찰하기 위해 전압민감성염료 이미징(VSDI), 이광자 이미징(TPEI), 고유광학신호이미징(OISI) 등의 생체광학 이미징 기법들을 통해 연구되었다. 이들 연구에서는, 초기 말초신경손상 후 7일 이내에는 신경세포의 활성 및 시냅스 가소성, 교세포 활성 및 세포외 글루탐산 증가 등, 대뇌의 활성화 반응이 나타났고, 그 이후(7일 ~ 약 4주)의 기간에서는 대뇌의 기능적 연결성(functional connectivity) 및 혈류역학 (hemodynamics) 반응이 낮아지는 것으로 나타났다. 하지만, 선행연구에서는 각 이미징 기법의 한계로 인해 단기 또는 장기 실험을 각각 진행하였고, 연속적인 종적 연구(longitudinal study) 결과로 보여주지 못하였다. 기존의 전임상 연구에서 보여지는 라벨링으로 인한 환자 적용의 어려움, 광학시야(field of view) 및 종적 측정의 한계는 전임상 연구 결과가 임상연구로 연계되지 못하는 한계로 이어진다. 반면, 고유광학신호 이미징(OISI) 기법은 대면적의 대뇌에서 활성화 영역 및 활성화 정도를 고해상도, 비지표적(non-labeling), 정량적으로 평가할 수 있는 방법으로, 전임상 동물모델의 대뇌기능을 중장기 종적 관찰에 활용할 수 있다. 또한 고유광학신호(OIS)는, 환자의 임상현장에서 사용하는 기능적자기공명영상(fMRI) 장치에서 혈류산소수준의존 이미징(Blood oxygen level-dependent imaging, BOLD) 신호와 시공간적으로 연관성을 보여준다. 특히 감각자극에 따른 고유광학신호(OIS) 반응은 시공간적으로 정량적인 특성이 있어, 고유광학신호 이미징(OISI) 기법을 통해 신경병증성 통증에 대한 대뇌의 반응의 특성을 정의하고, 중개연구 바이오마커로의 활용가능성을 보인다.

본 연구에서는 감각자극유발 고유광학신호(sensory evoked-OIS)의 관찰을 통해 말초신경병증성 통증 동물모델의 중개연구 바이오 마커로써의 활용가능성을 검증하고자 하였다. 전임상 동물 모델로는 좌골신경(sciatic nerve)의 일부분인 총비골신경(common peroneal nerve)과 경골 신경(tibial nerve)의 결찰술 (ligation)을 통해 좌측 뒷다리 말초신경에 손상을 유발한 말초신경병증성 통증 동물모델(spared nerve injury model, SNI model)을 이용하여 실험군(SNI)과 위시험군(Sham)의 대뇌 고유광학신호(OIS)의 차이를 확인하였다. 신경병증성 모델에서 나타나는 무해자극통증(allodynia) 증상을 고려하여, 통증을 유발하지 않는 감각자극(non-nociceptive sensory stimulation)을 통해 유발되는 비정상적인 통증 신호의 관찰을 위하여 3 Hz, 0.3 mA, 3 ms 펄스나비의 직류전류자극을 4초동안 가하는 전기자극 파라미터를 적용하였다. 3 Hz의 전기자극 주파수는 마우스의 생리적 신호의 주기(0.4 ~ 2 Hz 호흡관련 주파수 및 4 ~ 5 Hz 심박수 관련 주파수)를 고려하여 결정하였다.

전기자극에 대한 고유광학신호(OIS) 반응의 측정은 병변부위인 좌측 뒷다리 및 정상부위인 우측뒷다리에 대하여 수행하였고, SNI 그룹 및 Sham 그룹 모두 동일한 방법으로 진행하였다. 고유광학신호 이미지 (OISI)는 입사광은 525 nm LED를 사용하였으며, 10 fps의 셔터속도로, 18.33 msec의 센서 노출시간, 신호대잡음비 개선을 위하여 4 × 4 비닝의 측정조건으로 획득하였다. 수술 직전의 정상상태에서 D0, SNI 및 Sham 수술 직후 1, 3, 6, 15일차에 감각자극유발 고유광학신호(sensory evoked-OIS)을 측정하였다(D1, D3, D6, D15). 신호대잡음비 개선을 위하여 각 1회의 측정 결과의 분석은 총 20회의 측정된 결과를 누적평균하여 신호처리를 진행하였다. 측정한 이미지를 공간적 분석을 통하여 관심영역(ROI, S1HL)를 결정하고, ROI에서의 시간축 데이터를 획득하였다. 20회의 개별 시험결과로부터 각 픽셀에서의 시계열 데이터를 고속푸리에변환(Fast-Fourier transform)을 통하여 주파수축 데이터로 변환하였으며, 총 5개의 주파수 구간으로 구별하여 감각자극유발 고유광학신호의 전력분석을 진행하였다. 본 연구에서는 대뇌의 광학 신호중에서 혈류역학과 연관된 2 ~ 5 Hz 영역대의 고유광학신호(OIS)의 전력분석을 통하여 신경병증성 통증모델의 말초신경손상에 의한 고유광학신호 차이의 통계적인 유의성을 확인하였다.

연구결과, SNI 그룹에서 3일 이후, 6일, 15일까지 3 Hz 감각자극에 대한 대뇌의 좌측 뒷다리(contralateral S1HL) 영역 신호와 우측 뒷다리(ipsilateral S1HL)영역 신호 사이에 통계적으로 유의한 차이가 있었다(p < 0.05.) 또한, SNI Group에서 0일의 정상상태와 비교하여 3일 및 15일째의 3 Hz 감각자극에 대한 대뇌의 좌측 뒷다리(contralateral S1HL) 영역 신호는 통계적으로 유의한 차이가 있었다(각각 p < 0.05.) 이를 통해 SNI 모델은 SNI모델 내에서 3 Hz 감각자극에 대하여 좌우반구의 고유광학신호(OIS) 차이 및 발병의 전후의 고유광학신호(OIS) 차이를 통계적으로 확인하였다. 이와는 달리, Sham 그룹에서는 모든 일수에 대하여 3 Hz 감각자극에 대하여 좌우반구의 고유광학신호(OIS) 및 발병의 전후의 고유광학신호(OIS)에 통계적으로 유의한 차이가 없었다(p > 0.05). 마지막으로, SNI 그룹과 Sham 그룹의 병변부위인 좌측 뒷다리(contralateral S1HL) 영역의 고유광학신호(OIS)는 15일 이후에 통계적으로 유의미한 차이를 보였다(p > 0.05.) 이를 통하여, 3 Hz 감각자극 유발 고유광학신호(OIS)의 변화는 신경병증성 통증 동물모델에대한 intra-/inter-animal 바이오마커가 될 수 있음을확인하였다.|Peripheral neuropathic pain is “Pain caused by a lesion or disease of the peripheral somatosensory nervous system,” a geriatric disease such as herpes zoster, diabetes or damage to the peripheral nerves due to chemotherapy has been known to be the leading cause. Damage to the peripheral nerves causes physiological changes in the primary somatosensory cortex of the cerebrum, which causes the patient to suffer from chronic pain such as hyperalgesia and allodynia. Diagnosing and treating neuropathic pain early is crucial because it is a chronic pain that reduces the patient's quality of life and can worsen over time. Most chronic pain patients have a mixture of neuropathic pain and nociceptive pain. Therefore, in order to identify and diagnose the presence of neuropathic pain in chronic pain patients, the pain pattern, such as the site of pain and the type and size of pain, is identified through a questionnaire filled out by the patient or an interview with the examiner. However, this questionnaire and interview-based diagnosis methods are limited in that the diagnosis result is derived depending on the patient's subjective opinion.

Studies on biomarker candidates in various methods have continuously progressed for the early diagnosis of neuropathic pain and the quantitative and qualitative evaluation of pain and prognosis. In particular, there is a high interest in developing a translation biomarker that can be used in both clinical and preclinical trials; that is, it shows the same mechanism and pattern in experimental animals and humans. The development of these translation biomarkers is expected to play an essential role in the development of neuropathic pain and treatment mechanisms and therapeutics. Among various biomarkers of neuropathic pain, quantitative sensory testing (QST) is a promising candidate for sensory biomarkers and is pointed out as a prognostic marker for the pharmacological treatment of patients. However, conclusive evidence for this is still lacking, and further research is needed.

Various preclinical animal models have been proposed to study the mechanism of chronic pain caused by peripheral nerve damage. Also, it has been studied through in vivo optical imaging techniques such as voltage-sensitive dye imaging (VSDI,) two-photon excitation imaging (TPEI) and optical intrinsic signal imaging (OISI.) In these studies, cerebral activation responses such as neuronal activation and synaptic plasticity, glial cell activity, and extracellular glutamic acid increase were observed within 7 days of initial peripheral nerve injury, and the period after that (7 days to 4 weeks) showed that the functional connectivity and hemodynamic responses of the brain were lowered. However, in previous studies, short-term or long-term experiments were conducted separately due to the limitations of each imaging technique, and the results were not shown as a result of a continuous longitudinal study. In previous preclinical studies, difficulty in clinical application due to labeling-feature and limitations in the field of view and longitudinal measurements lead to limitations in which preclinical study results cannot be linked to clinical studies. On the other hand, the OISI technique is a non-labeling method and enables quantitative evaluation of the cerebral activation region with a large area and high resolution and can be used for mid-to-long-term longitudinal observation of cerebral functions in preclinical animal models. In addition, OIS shows spatiotemporal correlation with blood oxygen level-dependent imaging (BOLD) signals in functional magnetic resonance imaging (fMRI) devices used in the clinical practice of patients. In particular, the OIS response according to sensory stimulation has spatio-temporal quantitative characteristics, so it is possible to characterize cerebral changes due to neuropathic pain through the OISI technique. Therefore, OISI shows potential for use as a biomarker for translational research.

In this study, we tried to verify the applicability of 3 Hz sensory evoked-OIS as a translational biomarker for peripheral neuropathic pain in an animal model. In a preclinical animal model, peripheral neuropathy induced damage to the left hindlimb peripheral nerve through ligation of the common peroneal nerve and tibial nerve, which are part of the sciatic nerve. The difference in cerebral OIS was confirmed between the experimental group (SNI) and the sham group (Sham) using a spared nerve injury model (SNI model.) Considering the symptoms of allodynia in the neuropathic model, the non-noxious stimulation parameter 3 Hz, 0.3 mA direct current, and 3 ms pulse duration was given for 4 sec in order to observe abnormal pain signals induced by non-nociceptive sensory stimulation. The electrical stimulation frequency of 3 Hz was determined in consideration of the physiological frequency of the mouse (0.4 to 2 Hz respiration-related frequency and 4 to 5 Hz heart rate-related frequency).

Measurement of the OIS response to electrical stimulation was performed on the left hindlimb, the lesion site, and the right hindlimb, the normal site. Both the SNI group and the Sham group performed in the same way. OISI was obtained by a 525 nm LED for incident light, with a shutter speed of 10 fps and sensor exposure time of 18.33 msec, and measurement conditions of 4 × 4 binning to improve the signal-to-noise ratio (SNR). sensory evoked-OIS was measured on the day before SNI and sham surgery with the normal status and on the days 1, 3, 6, and 15 immediately after SNI/Sham surgery (D1, D3, D6, D15). In order to improve the SNR, the result of each session was analyzed by accumulating and averaging a total of 20 same trials, and then signal processing was performed. A region of interest (ROI, S1HL) was determined through spatial analysis of the measured image, and time-axis data in the ROI was acquired. Time-series data at each pixel in the ROIs from 20 individual test results were converted into frequency-axis data through the Fast-Fourier transform (FFT), The power analysis of the sensory stimulus-induced intrinsic optical signal was conducted by dividing it into a total of 5 frequency intervals. In this study, the power analysis of the OIS in the range of 2 ~ 5 Hz related to hemodynamics among the optical signals of the brain was conducted, and we statistically analyzed the sensory-evoked OIS difference due to peripheral nerve damage in the neuropathic pain model.

As a result of the study, there was a statistically significant difference between the signal from the contralateral S1HL region and the signal from the right hind limb (ipsilateral S1HL) region of the cerebrum for 3 Hz sensory stimulation on day 3, day 6, and day 15 in the SNI group. (p < 0.05.) Also, there was a statistically significant difference in the signal from the contralateral S1HL region of the cerebrum to 3 Hz sensory stimulation on days 3 and 15 compared to the normal state on day 0 in the SNI group (p < 0.05.) Therefore, the SNI model showed a statistically significant difference in sensory-evoked OIS between the left and right hemispheres and a change in the OIS for the 3 Hz sensory stimulation before and after the left hindlimb ligation. In contrast, in the Sham group, there was no statistically significant difference in sensory-evoked OIS between the left and right hemispheres and no changes in sensory-evoked OIS before and after the surgery for all experiment days (p > 0.05). Finally, the sensory-evoked OIS of the left lesion site (contralateral S1HL region) showed a statistically significant difference after 15 days between the SNI and the Sham group (p > 0.05.) Therefore, we confirmed that the 3 Hz sensory-evoked OIS change could be an intra-/inter-animal biomarker for the neuropathic pain animal model.