Identification and characterization of testis-specific long noncoding RNAs in mice

Abstract

Part I. 생쥐에서 정소 특이 긴 비암호화 RNA의 발굴 정자를 생산하기 위한 정자형성과정은 정소 특이 유전자들에 의해 정교하게 조절된다. 긴 비 암호화 RNA(long noncoding RNA; lncRNA)는 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 하지만, 생쥐 정소 특이 lncRNA의 포괄적인 분석이 이루어지지 않았다. 본 연구에서는 생쥐의 뇌, 심장, 신장, 간 및 정소 transcriptome에 대한 microarray 분석을 하였다. 그중 정소에서 조직 특이 lncRNA의 비율이 가장 높음을 확인했다(11%; 14,256 중 1,607). 또한, 정소는 많은 수의 조직 특이적 mRNA를 가지고 있지만, 그 비율은 lncRNA보다 낮음을 확인했다(7%; 1,090 of 16,587). 정소 특이 lncRNA를 위치적 특성에 따라 분류한 결과, 대다수가 단백질 암호화 유전자가 존재하지 않는 지역에 있는 long intergenic ncRNA(lincRNA)임을 확인했다. Genome 분석법을 통하여 250개의 단백질 암호화 유전자가 194개의 lincRNA 근처(≤ 10kb)에 있음을 확인하였고, Gene Ontology 분석 결과 이들은 전사 조절과 관련된 유전자임을 확인했다. 또한, 정소 관련 세포주(F9, GC-1 및 GC-2)의 transcriptome 분석을 통해 정소 특이 lncRNA중 일부가 각 세포주에서 발현함을 확인했다. 마지막으로, 발굴한 정소 특이 lncRNA 중 26개를 선정하여 in vitro 분석을 수행하였을 때, 실제로 정소 특이 발현을 보였으며 그중 23개는 생식세포에서만 발현함을 확인했다. 생쥐 정소 특이 lncRNA를 새롭게 발굴한 이 연구는 정소의 기능 및 정자형성과정에 관련된 lncRNA의 향후 연구에 도움이 될 것이다.

Part II. 생쥐에서 정소 특이 긴 비암호화 RNA Teshl의 기능 연구 열 충격 인자2(HSF2)는 생쥐의 정소에서 Y염색체의 일부 지역인 male-specific region of the Y chromosome long arm(MSYq)의 전사를 조절하지만, 이 전사 인자의 조직 특이성에 관한 분자 메커니즘은 알려지지 않았다. 본 연구에서는 앞서 발굴한 생식 세포 특이 긴 비암호화 RNA(lncRNA)인 NR_038002가 사람에게서도 정소 특이 발현을 보이는 LINC01921로 잘 보존됨을 확인하였다. 또한, NR_038002가 elongating spermatid의 핵에서 특징적인 시공간 발현을 보임을 확인했다. CRISPR/Cas9 유전자 제거 기술을 이용하여 NR_038002가 제거된 수컷 생쥐는 비정상적인 머리 형태를 가진 정자를 생산하고, 자손에서 여성 편향된 성비와 함께 감소된 생식능력을 나타냈다. 분자 수준의 연구를 통해서 NR_038002이 HSF2와 결합하여 MSYq 유전자들의 발현을 촉진함을 알아냈다. 따라서, NR_038002를 testicular germ cell-specific HSF2-interacting lncRNA(Teshl)로 새롭게 명명한다. 이 연구를 통해 HSF2의 정소 특이성이 Teshl에 의해 조절되고, Teshl-HSF2-MSYq 분자 기전 축이 Y염색체를 가진 정자의 기능을 도와줌으로써 출생 성비 균형을 유지함을 밝혔다.|PART I. Identification of testis-specific long noncoding RNAs in mice Spermatogenesis, which is the complex and highly regulated process of producing haploid spermatozoa, involves testis-specific transcripts. Recent studies have discovered that long noncoding RNAs (lncRNAs) are novel regulatory molecules that play important roles in various biological processes. However, there has been no report on the comprehensive identification of testis-specific lncRNAs in mice. I performed microarray analysis of transcripts from mouse brain, heart, kidney, liver and testis. I found that testis harbored the highest proportion of tissue-specific lncRNAs (11%; 1,607 of 14,256). Testis also harbored the largest number of tissue-specific mRNAs among the examined tissues, but the proportion was lower than that of lncRNAs (7%; 1,090 of 16,587). I categorized the testis-specific lncRNAs and found that a large portion corresponded to long intergenic ncRNAs (lincRNAs). Genomic analysis identified 250 protein-coding genes located near (≤ 10 kb) 194 of the loci encoding testis-specific lincRNAs. Gene ontology (GO) analysis showed that these protein-coding genes were enriched for transcriptional regulation-related terms. Analysis of male germ cell-related cell lines (F9, GC-1 and GC-2) revealed that some of the testis-specific lncRNAs were expressed in each of these cell lines. Finally, I arbitrarily selected 26 testis-specific lncRNAs and performed in vitro expression analysis. My results revealed that all of them were expressed exclusively in the testis, and 23 of the 26 showed germ cell-specific expression. This study provides a catalog of testis-specific lncRNAs and a basis for future investigation of the lncRNAs involved in spermatogenesis and testicular functions.

PART II. Characterization of a testis-specific long noncoding RNA Teshl in mice Heat shock factor 2 (HSF2) regulates the transcription of the male-specific region of the mouse Y chromosome long arm (MSYq) multicopy genes only in testes, but the molecular mechanism underlying this tissue specificity remains largely unknown. Here, we report that the novel mouse testicular germ cell-specific long noncoding RNA (lncRNA), NR_038002 displays a characteristic spatiotemporal expression pattern in the nuclei of round and elongating spermatids. NR_038002-knockout male mice produced sperm with abnormal head morphology and exhibited reduced fertility accompanied by a female-biased sex ratio in offspring. Molecular analyses revealed that NR_038002 interacts with HSF2 and thereby activates expression of the MSYq genes. We designate NR_038002 as testicular germ cell-specific HSF2-interacting lncRNA (Teshl). Taken together, our study is the first to demonstrate that the testis specificity of HSF2 activity is regulated by the lncRNA Teshl, and establishes a Teshl-HSF2-MSYq molecular axis for normal Y-bearing sperm qualities and consequent balanced offspring sex ratio.