Discovery of therapeutic candidates and biomarkers in HIV-1 infected patients using bulk RNA sequencing and single-cell sequencing

Abstract

인간 면역 결핍 바이러스 (HIV, human immunodeficiency virus)는 숙주 세포에 남아있는 바이러스의 전사 활성으로 다양한 치료제의 개발에도 불구하고 완치가 불가능한 것으로 알려져 있습니다. 또한 HIV-1 감염 후 임상 경과가 다양하게 나타나기 때문에 HIV-1 감염 환자에서 HIV-1의 전사 조절에 관여하는 면역 체계 연구의 필요성이 제시되고 있습니다. 본 연구에서는 HIV-1 감염 환자의 전사체학적 분석과 후성유전체학적 분석을 통해 HIV-1의 전사 조절에 관여하는 면역 체계를 확인하고자 하였습니다. 장기무증상감염인 (LTNP, Long term non progressor)은 별도의 약물 치료 없이 오랜 기간 정상 범위의 CD4+ T cell 개수를 유지할 수 있는 환자로 보고되고 있습니다. 본 연구에서는 bulk 수준에서 LTNP 환자와 비감염 환자의 전사체 비교분석으로 HIV-1의 전사 조절에 관여하는 면역 체계를 밝히고자 하였습니다. Bulk 수준의 전사체 분석으로 비감염인과 비교하였을 때 LTNP에서 TGF-beta 신호전달경로 관련 유전자가 증가하는 것을 확인하였습니다. 이를 통해 TGF-beta 신호전달경로가 HIV-1 전사 조절에 기여함을 알 수 있었습니다. Bulk 수준의 전사체 분석은 유전자 발현의 평균값으로 분석을 하고 세포 종류를 구분하지 못한다는 단점이 있습니다. 따라서 HIV-1의 주요 타겟 세포인 CD4 T cell 에서의 HIV-1 조절 메커니즘을 알아보기 위해서는 더 높은 해상도의 분석 방법이 필요하였습니다. 따라서 단일 세포 수준에서의 분석을 통해 HIV-1 초기 감염 환자의 세포 종류와 HIV-1 감염 세포에서의 메커니즘 분석을 시행하였습니다. 또한 초기 감염인 환자 유래 PBMC에서 HIV-1 감염 세포를 효과적으로 선별하기 위하여 나노포어를 사용한 DNA 시퀀싱 기술과 HIV-1 특이적 프라이머를 사용한 실험을 디자인 하였습니다. 단일 세포 수준에서 비감염 세포와 HIV-1 감염 세포의 전사체 비교분석을 통해 CD4 T cell에서 인터페론 반응과 JAK/STAT 신호전달 경로 관련 유전자들이 HIV-1 감염 세포에서 발현이 증가한 것을 확인했습니다. 또한 동일한 세포 내에서 전사 인자의 발현과 모티프 접근성을 비교함으로써 KLF2와 SP3의 활성이 HIV-1 감염 세포에서 높아지는 것을 확인했습니다. 결과적으로 본 연구에서는 HIV-1 감염인에 대해 다양한 수준의 분석으로 서로 다른 질병 경과에 관여하는 면역 메커니즘을 확인하고 CD4 T 세포에서 증가하는 HIV-1 전사 조절 인자를 식별할 수 있었습니다.|Complete clearance of HIV-1 is still a major public health issue. While antiretroviral therapy (ART) inhibits the replication of HIV-1, some proviruses are not eliminated and trigger variable disease progression. I identified the immune mechanisms of regulating HIV-1 transcription by applying the assay for profiling transcriptional and epigenetic signatures of HIV-1 infected patients. To discover the transcriptomic signatures of a rare type of HIV-1 infected patients, I performed bulk RNA sequencing analysis of Long-term non-progressors (LTNPs), who can spontaneously control HIV-1 replication without any treatment. From this analysis, I identified transforming growth factor-beta (TGF-beta) signaling pathway, which contributes to the spontaneous regulation of HIV-1, is enriched in LTNPs. To understand the cell types and immune mechanisms of HIV-1 early infected patients, I performed a single-cell analysis and designed an experiment to effectively capture more HIV-1+ cells for long-read Nanopore sequencing. Enriched pathway analysis shows that interferon responses and JAK/STAT signaling regulate HIV-1 transcription in CD4 T cells. Moreover, joint analysis of transcription factor (TF) expression and motif accessibility showed a significant increase in KLF2 and SP3 activity between HIV-1 infected cells and uninfected cells, suggesting these are the key regulators of HIV-1 transcription. Overall, the multimodal profiling shows the immune mechanisms of HIV-1 infected patients in different stages and discovers the upregulated HIV-1 transcription regulators in CD4 T cells.