Characterization of the structural and functional properties of tRNA specific N6-adenine methyltransferase, Mycoplasma capricolum TrmM

Abstract

tRNA 는 전사 후 다양한 변형을 거치며 메틸화는 흔하게 일어나는 변형 중에 하나이다. N6-methyladenosine (m6A) 는 DNA 와 RNA 에서 널리 관측되며 RNA 대사과정과 대표적인 후성유전적 신호 (epigenetic signal) 중에 하나이다. 최근 연구 결과에 따르면 m6A 가 여러 질병과 암에 관련 있다는 사실이 밝혀졌다. tRNA 에서는 여러 세균의 tRNAVal(UAC)의 37 번째 자리에서 발견되며 Escherichia coli 에서 yfiC 유전자가 메틸화효소인 TrmM 을 암호화한다는 것이 밝혀졌다. TrmM 은 Sadenosyl-L-methionine 을 methyl donor 로 사용하여 RNAVal(UAC)의 A37 자리를 메틸화하하는 효소이다. 하지만 TrmM 의 구조와 촉매 과정의 메커니즘에 대한 연구는 아직 미비하다. 이 논문에서 Mycoplasma capricolum TrmM 의 in vivo 와 in vitro 에서의 효소 활성을 액체 크로마토그래피 질량분석기를 통해 확인하였다. 또한 결정구조를 통해 M. capricolum TrmM 의 apo 형태와 S-adenosyl-L-homocysteine (SAH)이 결합된 구조를 구하였다. 나아가 M. capricolum TrmM 은 Escherichia coli TrmM 과 다른 기질 특이성을 보이며 oligomeric state 또한 다르게 나타난다. 놀라운 점은 M. capricolum TrmM 은 효소 활성을 위해서 2 가 금속 이온이 필요하며 이는 E. coli TrmM 과 또 다른 점이다. 마지막으로 M. capricolum TrmM 의 tRNA 결합 작용에 대해서 연구하기 위해 구조 기반 분석과 이를 바탕으로 putative tRNA binding residues 를 선정하여 mutation 을 진행하였다. 그 결과 Arg139 와 Arg168 이 tRNA 결합에 중요하다는 사실을 알게 되었다. 이번 연구를 통해 TrmM 의 구조와 기능에 대한 논의가 이루어질 수 있었다.|Transfer RNA (tRNA) undergoes post-transcriptional modifications and methylation is one of the common modifications. N6 -methyladenosine (m6A) is widely observed in DNA and RNA in all species which regulates epigenetic signals and RNA metabolism. Recent studies reveal that several diseases and cancers are related to m6A. In tRNA, this modification is only found in bacterial tRNAVal(UAC) at 37th position. In Escherichia coli, yfiC gene encoding TrmM was identified as SAM-dependent methyltransferase, which modifies A37 of tRNAVal(UAC). However, understanding of structure and catalytic mechanism of TrmM remains elusive. In this paper, in vivo and in vitro activities of Mycoplasma capricolum TrmM are confirmed by mass spectroscopy combined with liquid chromatography (LC-MS). Also, crystal structures of M. capricolum TrmM bound with and without S-adenosyl-L-homocysteine (SAH) are solved and display SAH binding sites. Furthermore, M. capricolum TrmM shows different substrate specificity and oligomeric state compared to E. coli TrmM. Surprisingly, M. capricolum TrmM requires divalent metal for its catalytic activity, unlike its E. coli homolog and other m6A methyltransferases. Finally, tRNA binding mode of M. capricolum TrmM is suggested from structural comparison and mutagenesis, where Arg139 and Arg168 are important for tRNA binding. From this research, relationship between structure and function of TrmM is discussed