CCN5 and Heart Diseases

Abstract

WNT1-inducible signaling pathway protein 2 (WISP-2)로도 알려진 CCN5는 cell communication network (CCN) 단백질들 중의 하나로, 세포 밖으로 분비되어 다양한 세포 활동에 관여한다. CCN5 단백질은 insulin-like growth factor binding protein (IGFBP), a von Willebrand factor type C (VWC), and a thrombospondin type 1 (TSP-1)의 세가지 도메인으로 이루어져 있지만, 다른 CCN 단백들의 경우 마지막에 C-terminal domain (CT)을 하나 더 가지고 있다. 우리 실험실에서는 이전에 이 CCN5가 심장섬유화의 진행을 막으며, 심지어 이미 형성된 심섬유화를 정상적으로 되돌리는 것을 발견하였다. 나는 이번 연구에서 3가지의 다른 주제로 CCN5를 다뤄보고자 한다. 먼저, 나는 CCN5를 구성하는 세가지 도메인들이 각각 근섬유아세포 (Myofibroblast)가 섬유아세포 (Fibroblast)로의 역분화에 어떠한 역할을 하는지 연구해보았다. 첫번째로 섬유아세포애 TGF-를처리하여근섬유아세포로분화를시킨후정제된CCN5 단백질, CCN5의 단일 도메인 단백질, 그리고 CCN5의 두개 도메인 단백질들을 처리하였다. 그 후, 세포면역염색법 (Immunocytochemistry), 세포분할법과 웨스턴 블랏팅을 통해 단백질들이 세포내로 들어가는지 유무와 세포내에서 어떠한 곳에 위치하는지를 관찰하였다. 또한 -SMA와 Fibronectin과 같은 섬유화 표지들을 통해 근섬유아세포의 역분화에 대한 활성도 측정하였다. 그 결과 CCN5는 대체적으로 Clathrin을 통하여 근섬유아세포 내로 함입되며, 세포내로의 함입 유무가 근섬유아세포의 역분화에 중요한 역할을 한다. 뿐만 아니라, TSP-1 도메인이 CCN5가 세포 안으로, 특히 핵으로 함입되는데 중요한 역할을 한다는 사실을 밝혀냈다. 그러나 TSP-1 도메인만 가지고는 CCN5의 항섬유화 효과를 보이기 힘들었으며 IGFBP나 VWC 같은 다른 도메인을 하나라도 동반되어야 그 활성을 보였다. 다음으로, CCN5를 통해 뒤센근위축증 (DMD)에 의한 심근병 치료에 대한 연구를 진행하였다. 뒤센근위축증은 유전질환으로 Dystrophin 유전자의 발현 문제에 의해 지속적인 근손실이 발생한다. 뒤센근위축증 환자는 어린시절부터 근손실에 의한 근육약화로 통증을 느끼며 나중엔 호흡기관과 심장 기능이 정상적으로 작동되지 않아 결국 사망에 이르게 된다. 특히, 뒤센근위축증 말기엔 심각한 심섬유화 관찰되는 것으로 알려져 있다. 난 뒤센근위축증 연구에 많이 사용되는 mdx/utrn (+/-) 쥐를 동물모델로 선정하여, 해당 동물 모델에 AAV.9 바이러스를 사용하여 CCN5를 과발현시켰다. 놀랍게도 CCN5를 과발현시킨 동물들은 심장기능이 확연하게 회복되었으며 심섬유화 역시 감소된 것을 확인할 수 있었다. 또한 Treadmill 실험 결과, CCN5가 해당 동물모델의 전반적인 운동 능력을 회복시켰다. 흥미롭게도 CCN5는 Dystrophin을 대체할 수 있는 것으로 알려진 Utrophin (UTRN) 발현 또한 증가시켰고, 해당 결과는 웨스턴블랏 분석법 뿐만 아니라 Luciferase 활성 분석법을 통해서도 증명하였다. 일련의 결과들은 뒤센근위축증의 치료제로서 CCN5를 연구해 볼만한 가능성이 있다는 점을 시사한다. 마지막으로, RNA 기반한 유전자 전달법은 최근 각광받고 있는 유전자 치료법이다. RNA 기반 유전자 전달법은 목표 유전자의 즉각적인 발현이 가능하기 때문에 급성병에 적용해 볼만하다. 금성심근경색 역시 금성병의 하나로 심장에서 발생한다. 다른 여러 심장질환들과 마찬가지로 급성심근경색 역시 심섬유화와 심기능의 이상이 관찰된다. 앞서 언급했듯이 CCN5는 심성유화의 발생을 막고, 이미 형성된 심섬유화 역시 회복시킬 수 있다. 따라서, 난 RNA 기반 유전자 전달법을 통해 CCN5 유전자를 심근경색 동물모델에 적용하였으며, 해당 실험은 두가지의 다른 시간차를 설정하여 진행되었다. 첫번째는 동물모델에 심근경색의 상황을 만든 후 바로 ModRNA-CCN5를 주사하고 한 주 뒤에 바로 심기능 및 여러 분자적 표지들을 확인하였다. 두번째는 심근경색 모델을 만든 후 2주 뒤 ModRNA-CCN5를 처리하였고 다시 2주 뒤에 심기능과 여러 분자적 표지들을 확인하였다. 심기능은 심초음파와 MRI를 통해 측정하였고, 여러 표지들의 분자적 수준의 변화는 조직면역염색법, 웨스턴블랏 분석법과 qRT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과, CCN5가 심실의 파열 없이 심근경색에 의한 심심섬유화 발생 및 심기능 이상을 막고, 더 나아가 이미 생성된 섬유화 및 심기능 약화를 회복시켰다. 결론적으로 CCN5 단백질은 섬유화를 감소시킴으로써 심장을 보호하는데 탁월한 효과를 가지고 있으며, 해당 단백질의 TSP-1 도메인은 CCN5의 항섬유화 효과에 중요한 역할을 한다.|The matricellular protein CCN5, also known as WNT1-inducible signaling pathway protein 2 (WISP-2), is a member of the cell communication network (CCN) family of proteins that regulate diverse cellular destinations. The CCN5 protein consists of three structural domains: an insulin-like growth factor binding protein (IGFBP), a von Willebrand factor type C (VWC), and a thrombospondin type 1 (TSP-1), but not a C-terminal domain (CT) that other CCN family have. In previous, our laboratory we found that CCN5 prevents cardiac fibrosis (CF) by counteracting the pro-fibrotic activity of CCN2 and reverses pre-established CF. In this research, I focused on the role of each domain of CCN5 in cardiac fibroblasts (FBs) and therapeutic effect of CCN5 in two different types of heart disease. Firstly, I set out to elucidate the roles of these domains in the context of the reverse trans-differentiation of myofibroblasts (MyoFBs) to FBs. First, human cardiac FBs were trans-differentiated to MyoFBs by treatment with TGF-; this was then reversed by treatment with recombinant human CCN5 protein or various recombinant proteins comprising individual or paired CCN5 domains. Subcellular localization of these recombinant proteins was analyzed by immunocytochemistry, cellular fractionation, and western blotting. Anti-fibrotic activity was also evaluated by examining expression of MyoFB-specific markers, -SMA and fibronectin. my data show that CCN5 is taken up by FBs and MyoFBs mainly via clathrin-mediated endocytosis, which is essential for the function of CCN5 during the reverse trans-differentiation of MyoFBs. Furthermore, I showed that the TSP-1 domain is essential and sufficient for endocytosis and nuclear localization of CCN5. However, the TSP-1 domain alone is not sufficient for the anti-fibrotic function of CCN5; either the IGFBP or VWC domain is needed in addition to the TSP-1 domain. Secondly, I hypothesized that CCN5 gene transfer would ameliorate CF and thus improve cardiac function in DMD-induced cardiomyopathy. Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a genetic disorder marked by progressive muscle degeneration due to mutations in the dystrophin gene. Patients with DMD initially suffer from muscle weakness in the limbs in their adolescence which develops into fatal respiratory and cardiac dysfunctions. During the later stage, severe CF is observed which compromises cardiac function. I utilized mdx/utrn (+/-) mice which exhibit DMD phenotype and used an adeno-associated virus serotype 9 (AAV.9) viral vector for CCN5 gene transfer. I evaluated onset of cardiac dysfunction by echocardiography and determined my experimental starting point at 13 months old mdx/utrn (+/-) mice. Post CCN5 gene transfer, cardiac function was significantly rescued and CF was ameliorated after 2 months. Additionally, running performance increased in CCN5 gene transferred mice. Furthermore, in sillico gene profiling analysis identified utrophin as a novel transcriptional target of CCN5. This was supplemented by a utrophin (UTRN) promoter assay and RNA seq analysis, which confirmed that CCN5 is directly associated with UTRN expression. The results show that CCN5 may be a promising therapeutic molecule for DMD-induced cardiac and skeletal dysfunction. Lastly, Recent year, RNA-mediated gene transfer is rising delivery method for gene therapy. RNA-mediated gene transfer is beneficial to promptly express target gene, so it is potent therapeutic method for acute disease. Myocardial infarction (MI) is one of the acute disorders taking place in the heart. MI hearts commonly show fibrotic deposition and incapacitated function. As I referred, our laboratory previously demonstrated that the matricellular protein CCN5 not only inhibit a CF, but also reverse the CF. Therefore, I attempted to deliver cardioprotective CCN5 to mouse MI model by RNA-mediated gene transfer and investigate the result. I set two different periodical experiments: 1) Preventive intervention: Modified mRNA-CCN5 (ModRNA-CCN5) was injected at the same time point of MI and the effects were analyzed within a week; and 2) Therapeutic intervention: ModRNA-CCN5 was injected at 2 weeks after MI and the effects were analyzed at 2 weeks later. At the end point, echocardiography and MRI were performed to measure changes in cardiac function. Additionally, the changes were investigated in molecular level by immunohistochemistry, western blotting and qRT-PCR. The results indicate that CCN5 inhibit or reverse the fibrosis progression in both short- or long-term intervention without LV rupture. In conclusion, CCN5 is obvious cardiac protecting protein that reduces fibrosis in diverse heart diseases and TSP-1 domain of the protein is essential for the anti-fibrotic function.