Biophysical investigation and application of MagR-MazE fusion protein and CAHS protein

Abstract

The unique properties of proteins, such as their high specificity, stability, and versatility, have made them attractive candidates for use in various biochemical applications. In this dissertation, we investigate the functional and structural properties of proteins in vitro and utilize their properties for biochemical applications. Specifically, we applied two different types of proteins in a diagnostic kit and utilized a specific motif that perform key functions in a protein to protect enzyme activity under extreme environments. First, to apply proteins to the diagnostic kit for PCR product, MagR protein, which Columbia livia uses to detect the direction of the Earth’s magnetic field and MazE protein, which regulates the toxin-antitoxin system in E. coli were fused. To protect enzyme activity under stress conditions, we utilized cytosolic abundant heat soluble protein (CAHS) derived from tardigrade which have extreme vitality in stressful environments. The first chapter describes a universal and simple detection strategy that uses magnetic nanoparticles (MNPs) and a novel MagR-MazE fusion protein for molecular diagnostics, facilitating sensitive detection of double-stranded DNA. To effectively control the spread of new infectious diseases, highly sensitive diagnostic methods are needed to rapidly detect viral nucleic acids. We have engineered a novel MNP conjugate that can be easily generated without using many chemical reagents. Our nucleic acid detection method employs MagR-MazE fusion protein-conjugated MNPs, and the results can be visualized with the naked eye, irrespective of the oligonucleotide sequences of the target in the lateral flow assay. Our method could sensitively detect polymerase chain reaction (PCR) products of 16S ribosomal RNA (rRNA) and the 2019-nCoV-N-positive control gene within 5 minutes, exhibiting a low limit of detection (LoD) of 0.013 ng/μL for dsDNA. Compared to other techniques, our method is simpler, more rapid, sensitive, and versatile, making it suitable for point-of-care testing. Our proposed detection system and MNP conjugation strategy using MagR-MazE fusion protein can be widely applied to various fields requiring rapid on-site diagnosis. In the second chapter, we revealed the function and property of CAHS and provided the basis for its biological application. Tardigrades are extraordinary microscopic creatures that survive in harsh conditions, including desiccation and extreme temperatures. Tardigrade-specific intrinsically disordered proteins (TDPs), including CAHS protein, play a crucial role in their survival. CAHS is known to protect enzyme activity in vitro under dehydrated conditions and enhance desiccation tolerance even in other species. However, the specific functions of each domain of CAHS and its mechanism have not been fully understood. Our study discovered that the highly conserved CAHS motif 1 (124-142) prevents the formation of protein aggregates and protects lactate dehydrogenase (LDH) activity during dehydration-rehydration and freeze-thaw treatments and that the N- and C-terminal domains of CAHS are more prone to aggregation under our experimental conditions. By identifying the specific functions of each domain in CAHS, our study suggests the possibility of using engineered CAHS-derived proteins or peptides for biological applications in the desiccation protection of biologics or industrial enzymes.|높은 특이성, 안정성, 다용성과 같은 단백질의 고유한 특성은 단백질을 생화학적으로 다앙하게 활용할 수 있는 매력적인 후보 물질로 만든다. 본 논문에서는 in vitro에서 단백질의 기능적, 구조적 특성을 조사하고 각 단백질의 특성을 생화학적으로 활용하였다. 우리는 두 종류의 다른 단백질을 각각 진단 키트에 적용하고 극한의 환경에서의 효소 활성 보호에 활용했다. 우선 단백질을 DNA진단 키트에 적용하기 위해서 Columbia livia 가 지구의 자기장을 탐지할 때 사용하는 MagR 단백질, E.Coli 의 toxin-antitoxin 시스템을 조절하는 MazE 단백질을 융합했다. 그리고 스트레스 환경에서 효소의 활성을 보호하기 위해서 극한의 생명력을 가진 tardigrade 에서 유래한 CAHS 단백질을 활용했다. 첫 번째 장에서는 분자 진단을 위해서 자기 나노입자 (Magnetic Nanoparticles, MNPs) 와 새로운 MagR-MazE 융합 단백질을 사용한 보편적이고 간단한 PCR product 검출 전략을 제시하였다. 새로운 감염성 질병의 확산을 효과적으로 제어하기 위해서는 바이러스 핵산을 빠르게 검출할 수 있는 고감도 진단 방법이 필요하다. 본 연구에서는 많은 화학 시약을 사용하지 않고 쉽게 생성할 수 있는 새로운 MNPs 결합체인 MagR-MazE 융합 단백질을 개발하였다. MagR-MazE 융합 단백질에 conjugation 한 MNPs를 이용한 본 연구의 핵산 진단법을 활용하면 검출하고자 하는 질병의 종류와 상관없이 Lateral flow assay (LFA) 를 통해 질병의 dsDNA 유전자를 검출하여 별도의 장비 없이 맨 눈으로 결과를 확인할 수 있다. 본 연구에서 개발한 진단법은 16S ribosomal RNA (rRNA) 및 2019-nCoV-N 양성 대조 유전자의 PCR 생성물을 5분 이내에 검출하였으며, 질병 유전자의 dsDNA의 최저 검출 한계 (Limit of Detection, LoD) 는 0.013 ng/μL로 나타났다. 본 연구에서 새로 개발한 LFA 시스템은 다른 기술에 비해 간단하고 빠르며 감도가 높고 활용 가능성이 높아 현장 검사에 사용하기에 적합하다. 우리가 개발한 MagR-MazE 융합 단백질을 활용한 MNPs conjugation 기반 LFA 시스템은 신속한 현장 진단이 필요한 다양한 분야에 널리 응용될 수 있다. 두 번째 장에서는 CAHS 단백질의 기능과 특성을 밝히고 생물학적인 응용 가능성에 대한 기초 연구 데이터를 제공했다. Tardigrade는 건조 환경과 극한의 온도를 비롯한 다양한 악조건에서 생존할 수 있는 생명체다. Tardigrade의 내재성 무질서 단백질 (Tardigrade disordered proteins, TDPs) 중 cytosolic-abundant heat soluble (CAHS) 단백질은 Tardigrade 가 극한의 환경에서 살아남는데 중요한 역할을 한다. CAHS는 건조한 상황에서 Tardigrade 의 내구성을 강화하고 탈수 상태에서 효소 활성을 보호하는데, 이는 효모와 대장균 같은 다른 종에서도 작용한다. 하지만 아직 CAHS의 각 도메인의 구체적인 기능과 메커니즘은 자세하게 알려져 있지 않았다. 우리는 본 연구에서 CAHS의 N-말단 및 C-말단 도메인이 단백질의 aggregation 에 관여하며, 높은 수준으로 보존된 CAHS motif 1 (124-142) 은 단백질의 aggregation 형성을 방지하고 탈수화-재수화 및 동결-해동 처리 시에 lactate dehydrogenase (LDH) 의 효소 활성을 보호한다는 것을 규명했다. 해당 연구를 통해 CAHS의 각 도메인의 구체적인 역할을 확인했으며, 이를 통해 CAHS 유래 단백질 또는 펩타이드가 생물학적 물질 (biologics) 또는 산업용 효소의 보호를 위해 공학적으로 활용될 수 있는 연구적인 기반을 제공하였다.