Binding mode and asymmetric degradation activity of ribonuclease H on the RNA/DNA hybrid substrates by single molecule FRET

Abstract

In cells, gene expression is regulated through decomposition after creation of RNA, and this process controls overall biological stages from growth, aging, and disease of living organisms. During degradation process of RNA, all types of cells commonly utilize RNase H as enzyme for degradation of RNA. The mutation of RNase H induce autoimmune disease such as Aicardi-Goutieres syndrome (AGS), and RNase H has been known as indispensable enzyme in Human Immunodeficiency Virus (HIV), regarding on Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS). Moreover, among RNA therapeutics that are being used as next-generation new drug technologies, ASO (antisense oligonucleotide) is designed to bind to a target transcript and degrade RNA by RNase H. This indicates that RNase H is not only a necessary component for basic cellular processes, but also a key component in the development of RNA therapeutics. So, for several decades, numerous studies have been performed to understand the mechanism of RNA degradation by RNase H. As a result, It was revealed that RNase H specifically binds to the chimeric junction, which is the part the changes from DNA:DNA (B-form) to RNA:DNA (A-form). Furthermore, the enzyme has been identified as an endonuclease that degrades RNA in a random and distributive manner. However, until recently, most studies have not been able to understand the dynamics of enzyme and the reaction of individual single molecule as a result of quantification of products changes, using gel electrophoresis. In order to understand the mechanism of RNase H in terms of kinetics and dynamics, I used single molecule FRET to analyze the interaction between RNase H and RNA:DNA hybrids and the RNA degradation reaction at the nanometer scale. In this study, not only RNA:DNA hybrids with a simple ii structure used in previous studies, but also RNA:DNA hybrids considering the structure of single-stranded DNA overhangs that have been overlooked in most studies despite their formation during the actual DNA replication process were used. I confirmed that RNase H not only showed different binding modes depending on the structure of the RNA:DNA hybrid, but also showed different kinetic properties of RNA degradation. When the orientation of the single-strand DNA overhang was 3’, RNase H preferentially bound to the 3’ overhang junction with strong affinity and the hydrolysis rate of RNase H enhanced. In addition, I newly discovered that RNase H, previously known only as an endonuclease, functions as an exonuclease that processively degrades RNA without falling off in the presence of 3’ single strand DNA overhang. On the other hand, when the orientation of the single strand DNA overhang was 5’, RNase H bound to the 5’overhang and chimeric junction with comparable affinity, and degrades RNA randomly and distributively by repeating binding and dissociation. In conclusion, I investigated the asymmetric degradation activity of RNase H according to the direction of DNA overhang. My findings is expected to provide academic foundation for research related to gene expression regulation by understanding the degradation mechanism of RNA, which is the basis of all living organisms. In addition, my research establish the foundation by discovering new exonuclease activity of RNase H, which is attracting attention as an AIDS drug candidate, and suggest theoretical basis for improvement of efficacy of ASO that is one of the RNA therapeutics.|세포 내에서 RNA는 생성 후 분해과정을 통해 유전자의 발현을 조절하며, 생명체의 성장과 노화, 질병에 이르기까지 전반적인 생물학적 단계를 관할합니다. 모든 계통의 세포에서, RNA 분해 효소로써 RNase H가 이용됩니다. 이 효소의 돌연변이는 Aicardi-Goutieres 증후군 (AGS)과 같은 각종 자가 면역 질환을 유발하며, 에이즈 질병과 관련된 HIV 바이러스에서 RNase H는 필수적인 단백질로 알려져 있습니다. 더불어, 차세대 미래 신약 기술로 활용되고 있는 RNA 치료제 중, ASO(antisense oligonucleotide)는 타겟 전사체에 결합한 후, RNase H에 의해 RNA를 분해하도록 설계되고 있습니다. 이는 RNase H가 기초적인 세포 과정에 필요한 구성 성분일 뿐만 아니라, RNA 치료제 개발에 핵심적인 요소임을 시사합니다. 따라서 수십 년간, RNase H에 의한 RNA 분해 기전을 이해하기 위해 수많은 연구들이 수행 되어왔으며, 그 결과 RNase H는 B 형태인 DNA:DNA에서 A 형태의 RNA:DNA으로 변화하는 부분인 키메릭 접합부를 특이적으로 인지하며, 무작위 적이고 분산적으로 RNA를 분해하는 endonuclease라는 것을 확인해왔습니다. 그러나 최근까지 대부분의 연구들은 전기 영동을 이용한 생산물 변화를 정량화하여 유추한 결과로써 효소의 움직임 및 개개의 단일 분자의 반응은 이해되지 않았습니다. 그래서 우리는 동력학적 측면에서 RNase H의 기전을 이해하기 위해서, 단일분자 형광 이미징 기술(single molecule FRET)을 이용하여 RNase H와 RNA:DNA 혼성체 사이의 상호작용과 RNA 분해 반응을 나노미터 수준의 정확도로 밀리초 단위에서 실시간으로 관찰하였습니다. 이번 연구에서는 기존 연구에서 많이 사용된 간단한 구조의 RNA:DNA 혼성체뿐만 아니라, 실제 DNA 복제 과정 중 형성됨에도 불구하고 대부분의 연구에서 간과된 단일 가닥의 DNA 오버행 구조를 고려한 RNA:DNA 혼성체를 이용하였습니다. 이번 연구에서,RNase H는 RNA:DNA 혼성체의 구조에 따라서 다른 결합 모드를 보여주었을 뿐만 아니라 RNA 분해의 동력학적 특성이 다르게 나타남이 확인되었습니다. 89 단일 가닥 DNA 오버행의 방향성이 3’일 경우, RNase H는 3’ 오버행 접합부에 강한 친화력으로 결합하였으며, RNase H의 가수분해 속도를 향상시켰습니다. 또한 우리는 기존에 endonuclease로만 알려진 RNase H가 3’ 단일 가닥 DNA 오버행이 있을 때, RNA로부터 떨어지지 않고 연속적으로 분해하는 exonuclease 기능을 한다는 것을 새로이 발견하였습니다. 반면에, 단일 가닥 DNA 오버행의 방향성이 5’일 경우, RNase H는 5’ 오버행 접합부와 키메릭 접합부에 결합하며, 결합과 해리를 반복하며 RNA를 무작위적이고 분산적으로 분해함을 확인하였습니다. 결론적으로 우리는 RNase H의 DNA 오버행의 방향성에 따른 비대칭적 분해 활성을 규명하였습니다. 먼저, 우리의 발견은 모든 생명체의 기본이라 할 수 있는 RNA의 분해 기전을 이해함으로써, 유전자 발현 조절 관련 연구에 학문적 토대를 제공할 것으로 기대됩니다. 그리고 우리의 연구는 에이즈 치료제 후보 물질로 주목받고 RNase H의 새로운 exonuclease 기능을 발견함으로써 에이즈 신약 개발에 활용될 수 있는 기반을 마련하며, RNA 치료제 중 하나인 ASO(antisense oligonucleotide)의 효능을 높일 수 있는 이론적 바탕을 제시합니다.